כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. עכברים מאתגרים ב-Vivo עם אימונוגלובולין וליפופוליסכריד תוך ורידי (IVIg+LPS) וקצירת מקרופאגים פריטוניאליים
- שקלו כל עכבר. חשב את נפח IVIg (ריכוז מלאי של 100 מ"ג / מ"ל) הדרוש כדי לספק מנה סופית של משקל גוף של 2.5 גרם / ק"ג. חשב את כמות LPS (ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל בתווך דולבקו של איסקוב (IMDM)) הדרוש כדי לספק מינון סופי של 0.2 מיקרוגרם/גרם משקל גוף.
הערה: לדוגמה, עבור עכבר של 20 גרם, נדרשים 500 μL של תמיסת מלאי IVIg ו- 40 μL של תמיסת 100 מיקרוגרם/מ"ל של LPS.
- משוך את הכמות הנדרשת של IVIg ו- LPS לתוך מזרק סטרילי של 1 מ"ל המצויד במחט סטרילית של 26 מד. עבור עכברי ביקורת שלא יקבלו IVIg, החלף נפח שווה ערך של IVIg במי מלח סטריליים חוצצי פוספט (PBS) pH 7.4.
- שפשף את העכבר ביד אחת על ידי תפיסת עורו בחלק האחורי של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה והחזקת זנבו ורגליו האחוריים עם האצבעות הנותרות. הטה את גופו לכיוון הקרקע.
- מניחים את המחט בזווית של 30 - 40 מעלות ביחס לבטן העכבר, ברביע הימני התחתון, משופעים כלפי מעלה ומכניסים 1.5 ס"מ. הזריקו את IVIg + LPS, או PBS + LPS, תוך צפקית.
- לאחר שעה אחת, בצע המתת חסד באמצעות חנק פחמן דו חמצני (CO2).
- הנח את העכבר בתא אינדוקציה. הרדימו את העכבר בהרדמה איזופלורנית 5%, למשך 60 - 90 שניות, עד לחוסר תנועה והנשימה עמוקה ואיטית.
- כבה את ההרדמה isoflurane ולתת 6-8 ליטר / דקה של CO2 עד העכבר מפסיק לנשום. השאר את העכבר עם CO2 דולק למשך 5 דקות נוספות לפחות. ודא שאין עוד דופק או נשימה. בצע נקע צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
הערה: עכברים בני 8 - 12 שבועות מספקים את התפוקה הגבוהה ביותר של מקרופאגים.
- הצמד את העכבר ללוח קצף, עם גפיים פרושות. רססו את החלקים באתנול 70%.
הערה: בצע את ההליך במכסה מנוע סטרילי.
- בצע חתך רדוד בעור (0.2 ס"מ) עם מספריים לאורך קו האמצע של העכבר, כדי למנוע חיתוך חלל הצפק. משוך את עור הבטן מבטן העכבר באמצעות מלקחיים, כך שבטנה של דופן הצפק השלמה גלויה.
- מלא מזרק 5 מ"ל עם 5 מ"ל של PBS סטרילי (pH 7.4). הכנס מחט באורך 25 או 27 מד בחלק העליון של החלל מצד שמאל או ימין לכיוון מרכז העכבר עם שיפוע המחט כלפי מעלה.
הערה: הניחו את המחט בזהירות בעכבר, כך שלא תזריקו PBS לאיברים, אלא לחלל הצפק.
- לדחוף את הנוזל לתוך חלל הצפק. משוך את המחט מהחלל ועסה את הצפק במשך 10 שניות כדי לעקור את כל התאים. הכנס את המחט בחלק העליון של החלל והימנע איברים. לאסוף ולהניח את נוזל שטיפה התאושש לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
הערה: עבור כל 5 מ"ל של נוזל מוזרק, כ 3.75 מ"ל יוחזר.
- הזרקה חוזרת והתאוששות (שלבים 1.8 - 1.9) 3 פעמים נוספות (נפח הזרקה כולל של 20 מ"ל), כדי לשחזר 15 מ"ל של נוזל שטיפה בסך הכל. לאסוף שטיפה מכל עכבר לתוך צינור חרוטי נפרד 15 מ"ל.
הערה: לאחר ההזרקה הסופית, ייתכן שיהיה קל יותר לחלץ את הנוזל מהצד השמאלי והימני הקיצוני של העכבר, שם הצטבר נוזל. האיברים יגרמו לפחות הפרעה למחט במיקום זה.
- סובב תאים כלפי מטה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להסיר 1 מ"ל של נוזל שטיפה שהתאושש ולהשתמש לניתוח אינטרלוקין או IL-10 ו- IL-12/23p40 על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) בהתאם להוראות היצרן או להקפיא ב -80 ° C לניתוחים עתידיים.
הערה: כדי להבטיח השוואה מדויקת בין טיפולים לניתוח ציטוקינים של נוזל שטיפה, בצע 5 מ"ל שטיפות של חלל הצפק 4 פעמים עבור נפח סופי של 15 מ"ל. לא כל הנוזלים יתאוששו מכל סומק.
- יש להשהות מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום ציפוי (IMDM, 10% סרום בקר עוברי, FBS ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין) לכל עכבר סמוק. לספור מקרופאגים קיימא.
הערה: המקרופאגים יהיו מעט גדולים יותר מתאי הצפק האחרים. התשואה האופיינית היא 5 x 105 - 1 x 106 מקרופאגים/עכבר באמצעות עכבר מסוג פראי C57BL/6.
אופציונלי: אם מספר גדול של תאי דם אדומים נמצאים בכדורית התא, בצע שלב ליזה על פי הוראות היצרן להסירם.
- תאי השעיה בתווך הציפוי ב 1 x 106 מקרופאגים / מ"ל וצלחת 100 μL לכל באר בצלחת טיפול בתרבית רקמה תחתונה שטוחה 96 באר.
הערה: ייתכן שיהיה צורך לאגד תאים מיותר מעכבר אחד לצורך ניסוי. לדוגמה, אם עכבר אחד היה 5 x 105 מקרופאגים, 500 μL של ציפוי בינוני היה נדרש.
- לדגור על תאים במשך שעה אחת ב-37°C, 5%CO2 כדי לאפשר למקרופאגים להידבק. התאים הדבקים הם המקרופאגים הצפקיים. הסר סופרנאטנטים של תאים ותאים שאינם דבקים. שטפו את הבארות פעמיים עם IMDM של 200 μL (שחומם מראש ל-37°C), המתינו 10 שניות והטו את הצלחת באיטיות. החלף את אמצעי הציפוי. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 30 דקות לפני הגירוי.
- לאחר ההדבקה, לעורר בארות כפולות או משולשות כל אחת עם 10 ng/mL של LPS ב- IMDM, 30 מ"ג / מ"ל של IVIg, או IVIg + LPS. מינונים של LPS או IVIg יכולים להיות טיטרציה כדי לייעל את התגובות. השאר בארות כפולות או משולשות כפקדים לא מגורים. לדגור אותם במשך 24 שעות (37 ° C, 5% CO2).
הערה: תאים מצופים מחדש צריכים להיצמד לבארות תרבית רקמה תוך שעה אחת. ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי או להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -80°C לצורך ניתוח ציטוקינים על ידי ELISA.
- אספו סופרנאטנטים של תאים מכל באר לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בודדות של 1.7 מ"ל והסירו כל חומר חלקיקי על ידי סיבוב במהירות של 10,000 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את התא supernatant ולמנוע להפריע את הכדור. מניחים את הסופרנאטנט התא המזוקק בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
הערה: ניתן לבדוק סופרנאטנטים של תאים עבור ציטוקינים, IL-10 ותת-יחידה של ציטוקינים, IL-12/23p40, על ידי ELISA באופן מיידי, או לאחסן בטמפרטורה של -80°C לטווח ארוך. פעל בהתאם לפרוטוקול ELISA מתוך הערכה המסחרית (Table of Materials). ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים ניתנים לבדיקה, כגון IL-6 וגורם נמק הגידול (TNF), שכן הם מופחתים גם על ידי טיפול משותף עם גירוי IVIg + LPS בהשוואה לגירוי עם LPS בלבד. לאחר הגירוי, ניתן להכין תאים דבקים לטכניקות כגון כתם מערבי או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (Q-PCR).
