הערכה של חסינות הנגרמת על ידי חיסון מפני זיהום חיידקי במודל עכבר

תקציר

מקור: זהירות, K., et al. הערכת תגובות פונדקאי-פתוגן ויעילות החיסון בעכברים. J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת יעילותו של חיסון שעלת אצלולרי נגד זיהום שעלת בורדטה בעכברים. לאחר החיסון, העכברים היו נתונים לזיהום, וההומוגנט הרקמתי שלהם תורבת כדי לנתח את מושבות החיידקים כקריאה של חסינות ההגנה הנגרמת על ידי החיסון.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיסון עכברים

1. הכינו תערובת חיסונים ראשית במאגר פיזיולוגי סטרילי כגון מלוחים או DPS.
   הערה: הנפח הכולל בתמהיל צריך לכלול 10% יותר מזה הנדרש לחיסון הקבוצה כולה. ריכוזי הרכב החיסון מפורטים להלן בשלבים 1.1.1 ו-1.1.2. העבירו את הפריטים לוויבריום על קרח.
   1. עבור מחקרי B. pertussis, כלול את קבוצות החיסון הבאות: חיסון שעלת אצלולרי (aPV) וגורם נשאות aPV + Bordetella A (BcfA). בנוסף, השתמש באלום, אנטיגנים חיסוניים בלבד (hemagglutinin נימה (FHA), ו pertactin (Prn)), ועכברים נאיביים (לא מחוסנים) כקבוצות ביקורת.
      הערה: aPV הוא 1/5^{מהמינון} האנושי של aPV שאושר על ידי ה- FDA, המורכב מקסואיד טטנוס, טוקסואיד דיפתריה מופחת, רעלן שעלת (PT), המגלוטינין נימה (FHA) ופרטקטין (Prn) שנספג למלחי אלומיניום. מנה אנושית אחת של שעלת נוכחית היא 0.5 מ"ל, ולכן, 1/5^מהמנה היא 0.1 מ"ל. נפחי aPV + BcfA הם 0.1 מ"ל של aPV (1/5^המינון האנושי) + 0.046 מ"ל של BcfA (30 מיקרוגרם) לעכבר. הנפח המרבי שניתן להעביר בבטחה לשריר אחד הוא 0.1 מ"ל. מכיוון שנפח החיסון aPV + BcfA גדול מ -0.1 מ"ל, החיסון חייב להיות מועבר לשתי הכתפיים, מחולק בערך באופן שווה, על מנת להינתן בבטחה.
   2. כדי להכין חיסון ניסיוני, עבור מנה אחת לשלב 1 מיקרוגרם של FHA ו 0.5 מיקרוגרם של Prn עם 50 מיקרוגרם של אלומיניום הידרוקסיד ג'ל PBS סטרילי. אפשר ל- aPV הניסיוני להתערבב על גליל מעבדה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, סובב את הצינור ב 18,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend את התוכן ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
2. בוויבריום, הגדירו את מכונת ההרדמה (איור 1).
   הערה: ודא שיש רמות נאותות של חמצן ואיזופלורן במיכלים המתאימים לפני השימוש. שוקלים את מיכל המטמון איזופלורן ומחליפים אותו כאשר משקלו עולה ב -50 גרם.
3. נקו היטב את ארון הבטיחות הביולוגי (BSC) והניחו את תא האינדוקציה הנקי בתוך ה-BSC. חבר את קווי ההרדמה והנבלות ממכונת ההרדמה לתא הזירוז. פתחו את מיכל החמצן דרך הרגולטור כדי לוודא שהחמצן זורם וכוונו את המפלס ל-1.5-2 ליטר/דקה.
4. הכניסו עכברים בגיל הרצוי (6-12 שבועות) לתא הזירוז. הפעל את האיזופלורן ל 2.5-3% על מנת להרדים קלות את העכברים. עקוב אחר בעלי החיים עד שהם אינם נעים בחדר ונשימתם הואטה.
5. בדוק את רמת האינדוקציה על ידי צביטת בהונות, התבוננות בכל תנועה רפלקסיבית. אם אין, אז העכברים מוכנים להזריק.
   הערה: בניסוי זה, כל כלוב החיות הורדם בבת אחת. ניתן לבחור להרדים בעלי חיים בנפרד להזרקה או להזריק לבעלי החיים ללא הרדמה. כל אחת מהשיטות הללו מתאימה.
6. בינתיים, הכינו מזרקי אינסולין 1 מ"ל (28G1/2) עם 0.1 מ"ל חיסון כל אחד. כאשר בעלי חיים מושרים במלואם, הוציאו בעל חיים אחד מהחדר והניחו את העכבר באופן גחוני על מגבת או כרית ספסל.
7. לנהל את החיסון תוך שרירית. עם המזרק בזווית של 45 מעלות ועם השיפוע פונה כלפי מעלה, הכנס את המזרק ~ 5 מ"מ לתוך הדלטואיד של העכבר והזריק את החיסון.
   הערה: ניתן להשתמש ברבע/אגף האחורי כאתר הזרקה במקום הדלטואיד.
8. לאחר ההזרקה, שמור את המחט מוחדרת לשריר במשך ~ 5-10 שניות. לאחר מסירת הנפח, סובבו את המזרק ב-180 מעלות כך שהשיפוע פונה הצידה כדי ליצור אטימה ולמנוע דליפה של החיסון. לאחר מכן, לאט למשוך את המחט מתוך אתר ההזרקה.
9. החזירו את העכבר לכלוב. חזור על ההליך עם כל בעלי החיים בקבוצה המיועדת.
10. כבו את האיזופלורן ושטפו את תא ההשראות בחמצן לפני הרדמת כלוב העכברים הבא.
11. עקוב אחר בעלי החיים עד שכולם ערניים ונעים בכלוב. החזירו את הכלוב למקום הדיור.
12. יש לעקוב אחר בעלי חיים כל 12 שעות לאחר החיסון, עד 48 שעות, לאיתור תסמינים קליניים של תחלואה כגון פרווה גסה/פרועה, הליכה איטית או נשימה מאומצת. אם התסמינים נמשכים, התייעצו עם הווטרינר המוסדי, והוציאו את העכברים מהמחקר במידת הצורך.
13. ארבעה שבועות לאחר החיסון הראשוני, להגביר עכברים על ידי הרדמה ומתן זריקות תוך שריריות לתוך deltoid ימין של העכבר עם אותו נוסחה החיסון שניתן בעבר.
14. שוב, לפקח על החיה עבור כל סימפטומים קליניים. חיות בית במשך שבועיים נוספים ולאחר מכן להמשיך עם זיהום.

2. מודל זיהום תוך אפי מורין

1. בוויבריום, הגדר תנאי חמצן והרדמה כמתואר בשלבים 1.3 ו -1.4. כפי שמתואר בשלב 1.5, הניחו את העכברים בחדר כדי להרדים. יש לעקוב אחר בעלי החיים עד שההרדמה תיכנס לתוקף.
2. כאשר העכברים מורדמים, הוציאו בעל חיים אחד בכל פעם מתא הזירוז. הרימו את העכבר על ידי קשקוש בית החזה הגבי, מאחורי השכמות והצוואר. מקם את העכבר זקוף כדי לגשת לאף.
3. בעזרת קצה פיפטה של 200 μL, מרחו באיטיות 40-50 μL של B. pertussis bacterial inoculum על נרס העכבר (20-25 μL בכל נר). החזק את העכבר עד שכל החיסון נשאף על ידי החיה. אם חלק מהחיסון מבעבע החוצה, אספו את הבועות והכניסו אותן מחדש לנארס. לספק כמות שווה של PBS סטרילי לקבוצה אחת של עכברים כביקורת שלילית.
4. כפי שנעשה בשלבים 1.10-1.12, החזירו את בעלי החיים המחוסנים לכלוב שלהם ועקבו אחר בעלי החיים עד שהם ערניים ונעים. החזירו את הכלוב לשטח הדיור המקורי שלו על המדף. שטפו את תא האינדוקציה בחמצן כדי להסיר את שאריות האיזופלורן לפני הרדמת קבוצת בעלי החיים הבאה. לפקח על בעלי החיים במשך 48 שעות לאחר ההדבקה.
5. במעבדה, דילול סדרתי של הצלחות של החיסון, ב-PBS סטרילי, כדי לאמת את היחידות יוצרות המושבה בפועל (CFUs) שנמסרו לעכברים. צלחת 0.1 מ"ל של דילולים על 10% צלחות BG + Sm (צלחות אגר Bordet-Gengou בתוספת 10% דם כבשים מנוטרל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) (איור 2A). מניחים את הצלחות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס וגדלים במשך 4 ימים. ספרו וחשבו את יחידות ה-CFUs מהחיסון שהועבר לעכבר (איור 2B).

3. קצירת רקמת בעלי חיים לאחר הדבקה

1. היכונו לנתיחת עכבר ולקצירת רקמות.
   1. יש לעקר את כל הכלים (מספריים גסים ועדינים, מספריים מעוקלים, מלקחיים עדינים, כדוריות ומפיצי משולשים) הדרושים לעיבוד רקמות באוטוקלאב. אטמו את הכלים בשקיות עיקור. עוטפים את הזכוכית, מקפיצים הומוגנייזרים בנייר כסף ומוסיפים סרט אוטוקלב כדי לציין סטריליות.
   2. הכינו צלחות אגר יום או יומיים לפני קציר הרקמות כדי להבטיח שהצלחות יתמצקו לפני השימוש. עבור B. pertussis, השתמש 10% BG + Sm. לוחות תווית עבור הריאה עבור כל עכבר עם דילולים רצויים, שנקבעו אמפירית עבור כל ניסוי.
   3. מלא ותייג צינורות דילול CFU. הוסף 0.9 מ"ל PBS סטרילי לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים של 1.5 מ"ל בהתבסס על מספר האיברים לעיבוד ודילול לכל איבר.
   4. שפופרות מילוי ותיוג לאיסוף רקמות:
      1. ריאות: הוסף 2 מ"ל קזאין סטרילי 1% ב- PBS לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל ואחסן ב -4 ° C. כדי לקצור ריאות עבור היסטולוגיה, הוסף 2 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF) ואחסן אותו ב- RT.
   5. אתנול טרי 70% צריך להיות מוכן למלא כוסות ובקבוקי ריסוס לנתיחה.
2. להעביר את כל החומרים לוויבריום על עגלה ביום הקציר. נקו את ה-BSC והגדירו את מכונת ההרדמה כמו בשלבים 1.3 ו-1.4.
3. הניחו את העכברים לניתוח בתא האינדוקציה, ועם זרימת חמצן, הפעילו את האיזופלורן ל-5% והמתינו עד שהחיות מאבדות את הכרתן. הסר עכברים אחד בכל פעם, ונקע את בעל החיים בצוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח מוות. לאחר פריקת צוואר הרחם, המתת חסד צריכה להיות מאושרת על ידי היעדר קצב נשימה ו / או היעדר רפלקס נסיגה (בדיקת צביטת בוהן).
4. מקם את העכבר, הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, על לוח הדיסקציה ונעץ את הידיים והרגליים פתוחות. רססו את גוף העכבר באתנול 70%.
5. בעזרת מלקחיים, אחזו את העור מתחת לבטן, במרכז האגן. בעזרת מספריים חדים, לעשות חתך אנכי עד הלסת התחתונה. לאחר מכן, נתחו את העור הרחק מדופן הצפק על ידי דחיפת שתי השכבות זו מזו, בתנועות קטנות עם מספריים סגורים. הניחו את העור בצידי הפגר כדי ליצור שדה ללא הפרעה לקצירת איברים סטרילית.
6. השתמש במלקחיים כדי לייצב את כלוב הצלעות בתהליך הקסיפואיד וחתך את הסרעפת. הריאות צריכות להתנפח וליפול לכיוון עמוד השדרה. פתח את כלוב הצלעות בצדדים כדי להסיר את לוחית החזה.
7. בודד והסר את האונה העליונה של הריאה הימנית, חיתוך עורקי הריאה וורידים. מניחים את האונה בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10% NBF ומניחים את הצינור ב- RT למשך 24 שעות לפחות כדי לתקן את הרקמה. בודדו את האונות הנותרות של הריאה הימנית והריאה השמאלית. מניחים את האונות בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של 1% קזאין ב- PBS ומניחים אותו על קרח.
8. יש להשליך את הפגר לשקית מסוכנת ביולוגית. לפני ניתוח החיה הבאה, לשטוף את הכלים עם מים deionized, ולאחר מכן מניחים אותם בכוס מלאה 70% אתנול. הסר את הכלים, לנער אתנול עודף, ולאחר מכן להמשיך עם הדיסקציה הבאה.
9. נתח כל עכבר לפי השלבים שהוזכרו לעיל.
10. לעבד את הרקמות כמתואר להלן.

4. עיבוד ריאות

1. להעביר את הריאות (ב 2 מ"ל של 1% קזאין PBS) לתוך סטרילי, 15 מ"ל Dounce homogenizer. השתמש מזיק כדי הומוגניזציה של רקמות. יש לנתק עד שלא נותרים חלקיקים גדולים של רקמה. החזירו את המתלה ההומוגני לצינור המקורי של 15 מ"ל.
2. הסר aliquot 0.3 מ"ל עבור ציפוי CFUs וצנטריפוגה הומוגנט ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאסוף aliquot ו aliquot את supernatant ב 0.5 מ"ל aliquots לתוך צינורות microcentrifuge מסומן מראש. לאחסן את הדגימות ב -20 °C עד ניתוח של ציטוקינים על ידי ELISA.
3. הכינו דילולים שנבחרו על ידי דילול סדרתי של 0.1 מ"ל של תרחיף הריאה ההומוגני בצינורות דילול (0.9 מ"ל של PBS סטרילי). צלחת 0.1 מ"ל של דילולים שנבחרו אמפירית על לוחות 10% BG + Sm מסומנים מראש ולהפיץ באמצעות מפזר משולשים סטרילי.
4. לדגור את הצלחות ב 37 ° C באוויר החדר במשך 4 ימים.
5. ספירה וחישוב של CFU/ריאה (איור 3). בקצרה, להכפיל מספרי CFU התאושש על ידי גורם דילול של הצלחת, ולאחר מכן גם על ידי נפח הכולל שבו האיבר עובד. חישובי CFU מומרים לאחר מכן לערכי Log₁₀ עבור כל חיה ומוצגים בגרף.
   1. צלחות עם 30-300 מושבות נספרות בקלות ובדייקנות. אין להשתמש בלוחות עם פחות מ -6 מושבות לחישובים מכיוון שמספרי מושבות נמוכים כאלה מציגים שגיאות. כדי לקבל גבול זיהוי נמוך יותר, הנפח הכולל שבו איבר היה הומוגני מחולק בנפח המשמש לזיהוי על צלחת מההומוגנט הלא מדולל (לדוגמה, נפח כולל של 2 מ"ל חלקי 0.1 מ"ל של הומוגנט לא מדולל שווה לגבול התחתון של 20 יחידות CFUs הניתנות לזיהוי).

תוצאות

איור 1: הגדרת מכונת הרדמה. מוצג וופורייזר הרדמה עם תא אינדוקציה מחובר ומערכת נבלות (בתוך ארון הבטיחות הביולוגי).

איור 2: חישוב החיסון התוך-אפי. (A) סכמטי של דילול סדרתי של חיסון זיהומי המדולל ^ל-10-4, ^{10-5 ו-10-6}. דילולים אלה מצופים על 10% BG + Sm, מוד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא אינדוקציה 2L	ציוד וטרינר	941444
פלוריזו	וטרינר וואן	V1 501017	כל מותג מתאים
קזאין	סיגמא	C-7078
בסיס Bordet Gengou Agar	BD bioscience	248200
מכשירים - מספריים, מספריים מעוקלים, מלקחיים, מלקחיים עדינים, מפזרי משולשים			כל מותג מתאים
15mL להקפיץ מטחנת רקמות	וויטון	357544	כל מותג דומה מתאים
הומוגנייזר ידני אלחוטי	Kontes/Sigma	Z359971-1EA	כל מותג דומה מתאים
מזרקים 3 מ"ל	BD bioscience	309657
15 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	339651
1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה	דנוויל	C2170
מזרק אינסולין 1 מ"ל 28G1/2	פישר סיינטיפיק/אקסל אינט.	14-841-31