דינמיקה של אברונים בלימפוציטים מסוג B לאחר הפעלה עם חרוזים מצופים אנטיגן

תקציר

מקור: Ibañez-Vega, J., et al., חקר דינמיקה של אברונים בתאי B במהלך היווצרות סינפסות חיסוניות. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לחקר הדינמיקה של אברוני הלימפוציטים מסוג B בעקבות הפעלתם עם מיקרו-כדוריות מצופות אנטיגן.

פרוטוקול

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות תאי IIA1.6 B.

1. הפעלת תאי B עם חרוזים מצופים אנטיגן

1. הכנת חרוזים מצופים אנטיגן
   1. כדי להפעיל תאי B, השתמשו ב-NH_2-beads המצופים באופן קוולנטי באנטיגן (חרוזים מצופים Ag), אשר מוכנים באמצעות 50 μL (~20 x 10⁶ חרוזים) של 3 מיקרומטר NH_2-beads עם אנטיגנים מפעילים (BCR-ligand+) או לא מפעילים (BCR-ligand-).
   2. עבור IIA1.6 תאי B משתמשים במקטע anti-IgG-F(ab')₂ כ-BCR-ligand+ ואנטי-IgM-F(ab')₂ או אלבומין בסרום בקר (BSA) כ-BCR-ligand-. כדי להפעיל תאי B ראשיים או קו תאי IgM+ B, השתמש ב- anti-IgM-F(ab')₂ כ- BCR-ligand+ וב- BSA כ- BCR-ligand-.
      הערה: כדי למנוע קשירה של ליגנדות לקולטן Fc, השתמש במקטעי נוגדנים F(ab') או F(ab')₂ במקום בנוגדנים באורך מלא.
   3. כדי להמשיך בהכנת חרוזים מצופים Ag, הניחו את החרוזים בצינורות מיקרוצנטריפוגות קושרות חלבון נמוכות כדי למקסם את התאוששות החרוזים במהלך מניפולציית הדגימה. הוסף 1 מ"ל של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) לשטיפת חרוזים וצנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נאנט.
   4. השהה מחדש את החרוזים עם 500 μL של 8% גלוטראלדהיד כדי להפעיל את קבוצות NH₂ וסובב במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
      זהירות: יש להשתמש בתמיסת מלאי גלוטראלדהיד רק במכסה אדים כימי. בצע את ההוראות בגיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS).
   5. חרוזי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 5 דקות, להסיר את גלוטראלדהיד, ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים נוספות עם 1 מ"ל של 1x PBS.
      זהירות: יש להשליך את תמיסת גלוטראלדהיד כפסולת כימית מסוכנת.
   6. השהה מחדש את החרוזים המופעלים ב 100 μL של 1x PBS. ניתן לחלק את הדגימה לשתי צינוריות מיקרוצנטריפוגות בעלות קישור חלבון נמוך: 50 μL עבור BCR-ligand+ ו-50 μL עבור BCR-ligand-.
   7. כדי להכין את תמיסת האנטיגן השתמש בשתי מיקרוצנטריפוגות 2 מ"ל קושרות חלבון נמוכות המכילות 100 מיקרוגרם / מ"ל של תמיסת אנטיגן ב 150 מיקרוליטר של PBS: צינור אחד עם BCR-ligand+ והשני עם BCR-ligand-.
   8. הוסף 50 μL של תמיסת חרוזים פעילים לכל צינור המכיל 150 μL של תמיסת אנטיגן, מערבולת, וסובב לילה ב 4 ° C.
   9. הוסף 500 μL של 10 מ"ג / מ"ל BSA כדי לחסום את שאר קבוצות NH₂ תגובתי על החרוזים ולסובב במשך 1 שעה ב 4 ° C.
   10. צנטריפוגו את החרוזים ב 16,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים עם קר 1x PBS שלוש פעמים נוספות.
   11. השהה מחדש את החרוזים המופעלים ב- 70 μL של PBS 1x.
   12. כדי לקבוע את הריכוז הסופי של חרוזים מצופים Ag, לדלל נפח קטן של חרוזים ב- PBS (1:200) ולספור באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן יש לאחסן ב-4°C עד לשימוש.
       הערה: אין לאחסן חרוזים מצופים Ag במשך יותר מחודש אחד.

2. הכנת כיסויי פולי-ל-ליזין

1. לפני בדיקת ההפעלה של תאי B עם חרוזים מצופים Ag, הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין (PLL-coverslips). השתמש בצינור 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של 0.01% w/v של תמיסת PLL וטבול את הכיסויים בקוטר 12 מ"מ בתמיסה. סובב לילה ב- RT.
2. שטפו את הכיסויים עם 1x PBS והשאירו לייבוש על מכסה צלחת 24 בארות מכוסה בסרט פרפין. המשך בהפעלת תאי B.

3. הפעלת תא B

1. כדי להתחיל את הפעלת תאי B עם חרוזים, תחילה לדלל את קו התאים IIA1.6 B ל- 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל בתווך CLICK (RPMI-1640 בתוספת 2 mM L-Alanine-L-Glutamine + 55 μM בטא-מרקפטואתנול + 1 mM פירובט + 100 U/mL פניצילין + 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) + 5% סרום בקר עוברי מומת חום [FBS]).
2. שלב 100 μL (150,000 תאים) של תאי IIA1.6 B עם חרוזים מצופים Ag ביחס של 1:1 בצינורות של 0.6 מ"ל. יש לערבב בעדינות באמצעות מערבולת ולזרוע על גבי כיסויי PLL. דגירה לנקודות זמן שונות באינקובטור תרבית תאים (37°C / 5% CO₂). נקודות הזמן האופייניות להפעלה הן 0, 30, 60 ו- 120 דקות. במשך זמן 0, הניחו את כיסויי PLL במכסה צלחת 24 בארות על קרח. מוסיפים את תערובת החרוזים המצופים ב-Cells-Ag ודגרים במשך 5 דקות על ice.
   הערה: חשוב לערבב על ידי מערבולת במקום pipeting למעלה ולמטה כי זה יכול להפחית את מספר החרוזים בדגימה, בשל הצטברות שלהם בקצה הפלסטיק של פיפטה. השתמש בחרוזים המצופים בליגנד BCR- כבקרה שלילית לכל בדיקה. אנו ממליצים להפעיל תחילה את זמן הדגירה הארוך ביותר ולאחר מכן את נקודות הזמן הבאות. חשב מרווחי הפעלה עבור דגימות כך שהם מוכנים לקיבוע בו זמנית.
3. הוסף 100 μL של PBS קר 1x לכל כיסוי כדי לעצור את ההפעלה ולהמשיך עם פרוטוקול immunofluorescence.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
IIA1.6 (גרסה A20) עכבר B-לימפומה תאים	ATCC	TIB-208	לימפומה של תאי B מורין ממקור Balb/c המבטאת BCR המכיל IgG על פני השטח שלה ללא FcγIIR
100% מתנול	פישר סיינטיפיק	A412-4
משקפי כיסוי בקוטר 10 מ"מ עובי מס' 1 עגול	מריאנפילד-סופיריור	111500
Amino-Dynabeads	תרמופישר	14307ד
אנטי פריצנטרין	אבקאם	dorit_1999	דילול 1:200 מומלץ אך צריך להיות אופטימלי
אנטי-ראב6	אבקאם	ab95954	דילול 1:200 מומלץ אך צריך להיות אופטימלי
אנטי-סק61	אבקאם	dorit_15575	דילול 1:200 מומלץ אך צריך להיות אופטימלי
BSA	וינקלר	BM-0150
מיקרוספרות אמינו Polybead 3.00μm	פוליסיינס	17145-5
פולי-ל-ליזין	סיגמא	P8920	לדלל במים סטריליים
RPMI-1640	תעשיות ביולוגיות	01-104-1א
טריטון X-100	מרק	9036-19-5
שפופרת 50 מ"ל	קורנינג	353043