הפעלת תאי B על גבי כיסוי מצופה אנטיגן

תקציר

מקור: Ibañez-Vega, J., et al., חקר דינמיקה של אברונים בתאי B במהלך היווצרות סינפסות חיסוניות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים הפעלת תאי B במבחנה. התהליך כולל אינטראקציה של אנטיגן עם קולטני תאי B, מה שמוביל לעיצוב מחדש של שלד ציטו-שלד, היווצרות סינפסות חיסוניות, תנועת ליזוזומים, הפנמת אנטיגן, עיבוד, ולאחר מכן הצגה על מולקולות MHC להפעלת תאי B.

פרוטוקול

1. הכנת כיסויי פולי-ל-ליזין

1. לפני בדיקת ההפעלה של תאי B עם חרוזים מצופים Ag, הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין (PLL-coverslips). השתמש בצינור 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של 0.01% w/v של תמיסת PLL וטבול את הכיסויים בקוטר 12 מ"מ בתמיסה. סובב לילה ב- RT.
2. שטפו את הכיסויים עם 1xPBS והניחו לייבוש על מכסה צלחת 24 בארות מכוסה בסרט פרפין. המשך בהפעלת תאי B.

2. הפעלת תאי B על כיסויים מצופים אנטיגן

1. הכנת כיסויים מצופים אנטיגן
   1. לפני ההפעלה, הכינו את תמיסת האנטיגן (1x PBS המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל BCR-ליגנד+ ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל חולדה נגד עכבר CD45R/B220).
   2. הערה: שקול להכין את תלושי הכיסוי יום לפני הבדיקה. B220 משפר את היצמדות תאי B, אולם BCR-Ligand+ מספיק כדי ליצור את תגובת ההתפשטות.
   3. הניחו את המכסה בקוטר 12 מ"מ על מכסה צלחת בקוטר 24 מ"מ המכוסה בסרט פרפין, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת אנטיגן לכל כיסוי, ודגרו על טמפרטורה של 4°C למשך הלילה. אטמו את הצלחת כדי למנוע אידוי של תמיסת אנטיגן.
   4. שטפו את הכיסויים עם 1x PBS וייבשו באוויר.
2. הפעלת תאי B
   1. כדי להתחיל בהפעלה, דלל תאי IIA1.6 B ל- 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל ב- CLICK medium + 5% FBS.
   2. הוסף 100 μL של תאים על מכסה מצופה אנטיגן (Ag-coverslip) והפעל עבור נקודות זמן שונות באינקובטור התא ב 37 ° C / 5% CO₂. נקודות הזמן האופייניות להפעלה הן 0, 30 ו- 60 דקות
      הערה: כמו בסעיף 1, אנו ממליצים להתחיל מנקודת זמן ההפעלה הארוכה ביותר על מנת לתקן את כל הדגימות בו זמנית.
   3. במשך זמן 0, הניחו את מכסה הצלחת בעל 24 הבארות המכיל את מכסה Ag-coverslip על קרח והוסיפו את התאים. דוגרים במשך 5 דקות על קרח.
   4. שאפו בזהירות את המדיה על כל Ag-coverslip ולאחר מכן הוסיפו 100 μL של 1x PBS קר כדי לעצור את ההפעלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
IIA1.6 (גרסה A20) עכבר B-לימפומה תאים	ATCC	TIB-208	לימפומה של תאי B מורין ממקור Balb/c המבטאת BCR המכיל IgG על פני השטח שלה ללא FcγIIR
CaCl2	וינקלר	CA-0520
גליצין	וינקלר	BM-0820
HyClone סרום בקר עוברי	תרמו פישר סיינטיפיק	SH30071.03	יש להשבית את החום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות
KCl	וינקלר	ת.ד. 1260
NaCl	וינקלר	SO-1455
פארפילם	מ	עמ' 1150-2
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	נוזל
פולי-ל-ליזין	סיגמא	P8920	לדלל במים סטריליים
RPMI-1640	תעשיות ביולוגיות	01-104-1א
נתרן פירובט	תרמו פישר סיינטיפיק	11360070
שפופרת 50 מ"ל	קורנינג	353043
2-מרקפטואתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	21985023
גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	35050061
נוגדן IgG נגד עכבר עיזים	ג'קסון מחקר חיסוני	315-005-003	ליגנד חיובי IIA1.6