השפעת נוגדן Anti C-fms על אוסטאוקלסטוגנזה בתאי מח עצם עכבר במבחנה

תקציר

מקור: Marahleh, A., et al. השפעת נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסטים והתפשטות של מבשר אוסטאוקלסט במבחנה. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מדגימים את ההשפעה של ריכוזי נוגדנים שונים נגד c-fms על אוסטאוקלסטוגנזה, שהיא תהליך היווצרות אוסטאוקלסטים מאבות אוסטאוקלסט.

פרוטוקול

1. דור BMM

1. זרעו 1 x 10⁷ תאים/10 מ"ל בכלי תרבית בקוטר 10 ס"מ והוסיפו M-CSF 100 ננוגרם/מ"ל. הריכוז הסופי של M-CSF הוא 100 ננוגרם/מ"ל של מדיום תרבית. לדגור על התרבית ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 3 ימים.
2. לאחר 3 ימים, הסר את מדיום התרבית, שטוף את התאים במרץ עם 10 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) פעמיים כדי להסיר תאים שאינם דבקים, להוסיף 5 מ"ל של טמפרטורת החדר 0.02% טריפסין-EDTA ב PBS, ולדגור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 5 דקות.
3. נתקו את התאים על ידי צנרת יסודית. יש לוודא שהתאים נותקו על ידי התבוננות בתרבית תחת מיקרוסקופ (התאים צריכים להיראות מעוגלים וצפים במדיה). אם התאים נשארים מחוברים, חזרו על הצנרת ביסודיות כדי לנתק אותם. כאשר התאים נותקו, הוסף 5 מ"ל של α-MEM כדי להשבית את התגובה.
4. אספו את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, ושטפו עם 5 מ"ל של α-MEM.
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות להשעות את הגלולה ב 10 מ"ל של α-MEM.
6. ביצוע ספירת תאים.
7. זרעו 1 x 10⁶ תאים/10 מ"ל בכלי תרבית בקוטר 10 ס"מ והוסיפו M-CSF 100 ng/mL. הריכוז הסופי של M-CSF הוא 100 ננוגרם/מ"ל של מדיום תרבית. לדגור על התרבית ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 3 ימים.

2. יצירת אוסטאוקלסטים מ-BMM כמבשרי אוסטאוקלסט

1. לאחר 3 ימים, קצרו את התאים המצורפים המייצגים BMM כמבשרי אוסטאוקלסט, לפי שלבים 1.2-1.7.
2. זרע BMM ב 5 x 10⁴ תאים / 200 μL של α-MEM בצלחת 96 באר. יש להוסיף RANKL לריכוז סופי של 50 נ"ג/מ"ל או TNF-α לריכוז סופי של 100 נ"ג/מ"ל. הוסיפו M-CSF לקבלת ריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל לכל באר.
3. הוסף נוגדן anti-c-fms (ריכוזים סופיים של 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) לכל באר.
4. יש לדגור ב-37°C, 5% CO₂ למשך 4 ימים. החליפו מדיה אחת ליומיים במשך 4 ימים.

3. כתם חומצה פוספטאז עמיד לטרטרט (TRAP)

1. לאחר 4 ימים של דגירה, בעדינות לשאוף את המדיום התרבית של כל באר. לשטוף כל באר פעם אחת עם 200 μL של טמפרטורת החדר 1x PBS.
2. מוסיפים 200 μL של 10% פורמלין לכל באר לקיבוע ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שואפים את הפורמלין ושוטפים כל באר 3 פעמים במים נטולי יונים.
3. יש להוסיף 200 μL של 0.2% Triton X-100 ב-PBS לכל באר לחדירה ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שאפו את הטריטון X-100 ושטפו כל באר 3 פעמים במים נטולי יונים.
4. הוסף 200 μL של תמיסת כתמים TRAP לכל באר. דמיינו את הכתם מתחת למיקרוסקופ. זה ייקח בין 10-30 דקות עבור הכתם להתפתח כראוי.
5. שאפו את הכתם ושטפו כל באר במים נטולי יונים, וייבשו באוויר. יש לשמור אותו בטמפרטורת החדר לשימוש בהשגחה נוספת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן Anti-c-FMS			AFS98, נוגדן חד-שבטי של חולדה, נוגדן אנטימורין, c-Fms (IgG2a)
רנקל	פפרוטק	315-11	רקומביננטי Murine sRANK Ligand, מקור: E.coli
M-CSF			רקומביננטי אנושי M-CSF. 1/10 כרך של תרבית קו תאים CMG14-12 supernatant בתאים 5X106 בצלחת תרבית תרחיף 10 ס"מ.
α-MEM	וואקו		עם L-גלוטמין ופנול אדום
סרום בקר עוברי	ביוווסט	S1820-500	סרום בקר עוברי ממוצא צרפתי
מנה תרבותית	קורנינג		צלחת בסגנון 100 מ"מ x 20 מ"מ
צלחת 96 באר	תרמופישר סיינטיפיק		משטח דלתא נון קלון