1. זיהום ויראלי בדרוזופילה
- להדביק זבובים על ידי הזרקת ננו ולבצע בדיקות הישרדות.
- משכו את הנימים להכנת מחטי ההזרקה, מלאו בחזרה את מחט ההזרקה בשמן והרכיבו את המזרק.
- הרדמה עפה על הפד תחת זרימה קלה של CO2. חיסון זבובים על ידי הזרקה תוך חזה של 50.6 nL של תמיסת וירוס (100 PFU, מדולל עם חיץ Tris-HCl, pH 7.2). הזריקו לפחות 3 בקבוקונים של זבובים (20 זבובים לכל בקבוקון).
הערה: ההזרקה גוזלת זמן רב (בדרך כלל 100 זבובים בשעה) ושכפול וירוס דרוזופילה C (DCV) מהיר מאוד, ולכן חשוב מאוד לרשום את הזמן המדויק על הצינורית לאחר סיום כל בקבוקון (20 זבובים). הזרקת המאגר בלבד מוגדרת כפקד דמה. בדרך כלל, זבובים בוגרים זכרים עדיפים, מכיוון שהתוצאות יציבות וניתנות להתרבות יותר מאשר בעת שימוש בנקבות, שכן שינויים הורמונליים במהלך ההזדווגות והרבייה עשויים להשפיע על קריאת הנקבות.
- לגדל את הזבובים המוזרקים ב 25 ° C, 60% לחות תחת מחזור אור / חושך רגיל. לספק לזבובי מזון טרי מדי יום, ולתעד את מספר הזבובים המתים.
- בצע לפחות 3 שכפולים ביולוגיים והתווה את עקומת ההישרדות.
- לצורך ניתוח סטטיסטי של נתוני הישרדות, יש ליצור עקומות הישרדות של קפלן-מאייר באמצעות תוכנה סטטיסטית. בצע בדיקת דירוג יומן כדי לחשב את ערכי P. בטבלת ההישרדות, הזן מידע עבור כל נושא. לאחר מכן התוכנה מחשבת את אחוזי ההישרדות בכל פעם ומתווה עלילת הישרדות קפלן-מאייר.
הערה: אין להוסיף שמרים נוספים לבקבוקון. בהשוואה לבקרות מדומה, לזבובים נגועים ב-DCV יש מדי פעם מיימת והם מגושמים, מה שהופך אותם לפגיעים לשמרים דביקים. עדיף לתעד יותר נקודות זמן בניסוי הראשוני כדי לגלות מסגרת זמן שבה יתרחש המוות המסיבי עבור זבובים נגועים. בדרך כלל, הזבובים הנגועים מתים רק לעתים רחוקות ביומיים הראשונים, אפילו עבור קווי מוטציות Dicer-2. עבור זבוב w1118 ללא וולבכיה (בלומינגטון 5905) נגוע ב-100 PFU של DCV, חלון הזמן הזה הוא כ-3-5 ימים לאחר ההדבקה. זבובי פירות שמתים תוך 0.5 שעות לאחר ההזרקה לא צריכים להיחשב כתמותה מכיוון שהם עלולים להיהרג על ידי פגיעה במחט ולא על ידי זיהום ויראלי.
2. מדידת עומס DCV על ידי בדיקת אפקט ציטופתי (CPE)
- ביום הראשון, הדביקו זבובים זכרים כמתואר בשלבים 1.1.1-1.1.2. קבצו את הזבובים המוזרקים בקבוצות של 20 זבובים ושמרו עליהם גדלים על מזון זבובים טרי למשך הזמן הרצוי (בדרך כלל למשך 24 שעות או 3 ימים). לספק לזבובים מזון טרי מדי יום.
- ביום השני, זרעו תאי דרוזופילה S2* בצלחת תרבית תאים של 10 ס"מ לצפיפות של כ 5 x106 עד 1x107 תאים / מ"ל.
- ביום השלישי, אספו 5 זבובים (תחת זרימה קלה של CO2) וטחנו אותם בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל למשך 30 שניות עם 200 מיקרוליטר של חיץ טריס וחרוזים קרמיים באמצעות הומוגנייזר. אחסן את הדגימות ב -80 °C או מיד להמשיך לשלב הבא.
- מערבלים היטב את המדגם. השתמש מזרק 1 מ"ל ומסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל.
- בצע דילול סדרתי פי 10 של הסופרנאטנט עם תווך מלא עבור תאי S2*. מוסיפים 50 μL דילול לתוך הבאר. הוסף 50 μL של מדיום תרבית ללא וירוס לבאר המסווגת כבאר הבקרה השלילית.
הערה: עבור כל קצב דילול נעשה שימוש ב-8 בארות. מכיוון שתשואת DCV טיפוסית היא סביב 108-10 9 PFU/mL, הדילול צריך לפחות לכסות ~ 10-5-10-10.
- ביום הרביעי, צפו ב-CPE במיקרוסקופ בעל שדה בהיר עם מטרה של 20X או 40X. סווגו באר שבה התאים נראים מטושטשים, והתווך מלא בשברים כ"באר חיובית", ובאר שבה המורפולוגיה של התא תקינה כ"באר שלילית".
- סמן בארות CPE חיוביות או שליליות עם + או –, בהתאמה. חישוב המינון הממוצע של תרבית רקמת הנגיף (TCID50).
3. עומס DCV נמדד על ידי qRT-PCR
- ביום הראשון, להדביק זבובים כמתואר לעיל. קבצו זבובים זכרים מוזרקים (20 זבובים לקבוצה) וגידלו אותם על מזון זבובים טרי למשך הזמן הרצוי, בדרך כלל במשך 24 שעות או 3 ימים. לספק לזבובים מזון טרי מדי יום.
- ביום השלישי, לאסוף 5 זבובים תחת זרימה קלה של CO2 בצינור 1.5 מ"ל עם 200 μL של חיץ ליזיס ו 20 חרוזים קרמיים (קוטר = 0.5 מ"מ), ולטחון את הדגימות על ידי homogenizer במהירות גבוהה במשך 30 שניות. להוסיף 800 μL של חיץ ליזה נוסף לכל צינור ולאחסן את הדגימות ב -80 ° C או מיד לבצע מיצוי RNA qRT-PCR.
- הכינו טיפים, צינורות, ומים מסוננים עם קרום 0.22 מיקרומטר שעברו דה-יוניזציה, דיאתילפירוקרבונט (DEPC) ומים מסוננים בקרום 0.22 מיקרומטר. הוסיפו 200 מיקרוליטר כלורופורם (≥99.5%) לדגימה ונערו נמרצות במשך 15 שניות ביד. יש לדגור במשך 5 דקות או יותר בטמפרטורת החדר עד ששלב המים והשלב האורגני מופרדים בבירור.
הערה: כלורופורם מסוכן ביותר ויש לטפל בו בזהירות. אין לערבל את הדגימה, מה שיגדיל את הסיכון לזיהום DNA.
- דגימות צנטריפוגות ב 13,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- לאסוף 400 μL של supernatant ולהעביר את supernatant לצינורות חדשים. יש לערבב עם אותו נפח של איזופרופנול (≥ 99.5%), להפוך בעדינות את הדגימות 20 פעמים ביד, ולאחר מכן לזרז במשך 10 דקות או יותר בטמפרטורת החדר.
הערה: משקעים ב -20 °C (75 °F) יגדיל את תשואת RNA.
- דגימות צנטריפוגות ב 13,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. כדורי RNA לבנים נראים בתחתית הצינור.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף 1 מ"ל אתנול 70% (אתנול במי DEPC) ולהפוך כמה פעמים כדי לשטוף את הרנ"א.
- דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 13,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט והרנ"א היבש למשך 5-10 דקות; RNA צריך להיות שקוף.
- הוסף 50 μL של מים DEPC לדגימה, פיפטה כמה פעמים, מערבולת.
- קח 3 μL של RNA עבור titrating ריכוז RNA. כמת את הרנ"א ב-260 ננומטר. בדרך כלל, ריכוז הרנ"א המופק על ידי פרוטוקול זה הוא כ 100-500 מיקרוגרם / μL, אשר מתאים לסינתזה cDNA.
- השתמש 2 מיקרוגרם של RNA עבור סינתזת cDNA. לדלל את הדגימה ל 100 μL עם ddH2O ולאחסן ב -20 ° C.
- בצע qRT-PCR בהתאם להוראות היצרן והפעל את qRT-PCR.
הערה: עבור סינתזת cDNA של DCV, פריימרים אקראיים עבדו הרבה יותר טוב מאשר פריימרים Poly A. ביטוי DCV mRNA מנורמל לחלבון ריבוזומלי אנדוגני 49 (rp49) mRNA. פריימרים אוליגונוקלאוטידים המשמשים בחלק זה:
RP49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (קדימה) ו-
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (הפוך);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (קדימה) ו
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (הפוך);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (קדימה) ו
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (הפוך);
RNA המושרה על ידי וירוס 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (קדימה) ו
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (הפוך).