כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת עכברים ו- DSS
- יש לשמור את עכברי הנוקאאוט (α-gustducin-/-) ואת עכברי C57BL/6 תואמי גיל, מין וגוף (α-gustducin+/+) C57BL/6 בכלובים נקיים.
הערה: עכברי הנוקאאוט הוצלבו עם עכברי C57BL/6 במשך למעלה מ-20 דורות ויש להם כמעט 100% C57BL/6 רקע גנטי.
- יש להמיס 30 גרם של אבקת נתרן דקסטרן סולפט (DSS) בליטר אחד של מים אוטוקלאביים. מערבבים עד שהתמיסה מתבהרת כדי להבטיח שריכוז העבודה הסופי הוא 3% (w/v).
הערה: ניתן לאחסן את פתרון DSS בטמפרטורת החדר עד שבוע או בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
2. אינדוקציה והערכה של קוליטיס DSS בעכברים
- שקול ורשום את משקל הגוף ההתחלתי של כל עכבר. הכניסו את העכברים בנפרד לכלובי פלסטיק סטנדרטיים ותייגו את הכלובים.
- החליפו את מי השתייה הרגילים בתמיסת DSS של 3% למשך 7 ימים בסך הכל, שאליהם יש לשתי קבוצות העכברים גישה ל-ad libitum.
- מדוד את משקל הגוף של העכבר, רשום את צריכת פתרון DSS ואסוף ובדוק את הצואה של כל עכבר מדי יום במהלך מתן DSS. שימו לב לחומרת השלשולים והדימום הרקטלי והמירו זאת למדד המחלה הנגרמת על ידי DSS.
- במהלך הניסוי, אחוז הירידה במשקל בהשוואה למשקל ההתחלתי ומדד המחלה מחושבים כדי להעריך את הסימפטומים של קוליטיס.
הערה: מדד המחלה מדורג על ידי שילוב תצפיות של שלשולים ודימום רקטלי ומוגדר כדלקמן: 0 (צואה רגילה, ללא דם), 1 (צואה רכה, ללא דם), 2 (צואה רכה, מעט דם), 3 (צואה רכה מאוד, דימום מתון) ו -4 (צואה מימית, דימום משמעותי). מדד המחלה מנותח מדי יום עבור כל עכבר.
- בסוף הטיפול בן 7 הימים ב- DSS, הקריבו את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם והמשיכו בניסויים הנותרים.
3. הכנת דגימות רקמה
- מניחים את העכבר במצב שכיבה ולנקות את העור של הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך קו אמצע באורך 3 ס"מ בבטן עם זוג מספריים קטנים כדי לחשוף את חלל הבטן.
- השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד בזהירות את הטחול מרקמות אחרות, ולאחר מכן להסיר את הטחול ולמדוד את גודלו.
- לזהות ולהרים את המעי הגס עם מלקחיים ולהפריד אותו מן mesentery שמסביב. משוך את המעי הגס כולו עד שהצקום ופי הטבעת גלויים.
- בודד את המעי הגס על ידי טרנסקטציה שלו בשולי המעי הגס ובעומק האגן כדי לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי והדיסטלי, בהתאמה. לאחר מכן, מדדו ותיעדו את אורך המעי הגס המבודד. היזהר שלא לפגוע ברקמת המעי הגס במהלך הליך הניתוח.
- שטפו את המעי הגס עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS) עם מזרק 10 מ"ל מצויד במחט gavage כדי להסיר את הצואה והדם עד שהפולט ברור לחלוטין.
- לזיהוי היסטולוגי, חלקו את דגימות הרקמה באופן שווה לשלושה חלקים: פרוקסימלי, אמצעי ודיסטלי. לאחר מכן, תקן את הרקמה עם 4% paraformaldehyde (PFA) לילה ב 4 ° C.
4. הערכה היסטולוגית של חומרת קוליטיס הנגרמת על ידי DSS
- צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
- לאחר הקיבוע, לטבול את הרקמה בתמיסה של 30% סוכרוז ב 1x PBS לילה בצינור 15 מ"ל כדי cryoprotect על הדגימות.
- הטמיעו את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והניחו אותה בטמפרטורה של -20°C עד שה-OCT יתקשה.
- מעבירים את בלוק ה-OCT המכיל את הרקמה להקפאה, מגדירים את חוגת העובי בהקפאה ל-12 מיקרומטר, פורסים ואוספים מקטעים קפואים בעובי 12 מיקרומטר.
- מחממים את חלקי הרקמה שנאספו מהקפאה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על צלחת חמה.
- שטפו את החלקים לזמן קצר במים מזוקקים. הכתימו אותם בתמיסת צביעת המטוקסילין למשך 5 דקות ולאחר מכן שטפו במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
- להבדיל בין החלקים עם 0.5% חומצה הידרוכלורית-אתנול במשך 30 שניות ולשטוף אותם במי ברז זורמים במשך 1 דקה. לאחר מכן, בצע את הכביסה ב 1x PBS במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מי ברז זורמים במשך 5 דקות.
- בצע שטיפה של חלקי הרקמה ב 70%, 75%, 80%, ו 95% אלכוהול, כל אחד במשך 10 שניות. כתם נגדי בתמיסת צביעת eosin במשך 2 דקות.
- יש לבצע התייבשות באמצעות 95% אלכוהול ו-2 החלפות של אלכוהול מוחלט למשך 5 דקות בכל פעם. נקה ב 2 שינויים של xylene במשך 5 דקות.
- ציון נזק לרקמות של המעי הגס הפרוקסימלי, האמצעי והדיסטלי של כל עכבר הן עבור נוקאאוט הגן והן עבור קבוצות מסוג פרא בהתבסס על תוצאות צביעת H&E לעיל.
הערה: מדד המחלה הוא ציון משולב של נזק אפיתל ודלקת באזורי הרירית, התת-רירית, השרירים והסרוסה המוגדרים כך: 0 (ללא נזק ודלקת לרקמות), 1 (נזק ודלקת לרקמות מוקדיות), 2 (נזק ודלקת לרקמות טלאיות) ו-3 (נזק מפוזר לרקמות ודלקת). לאחר מכן מסוכמים שלושה ציונים לכל עכבר עבור החלקים הפרוקסימליים, האמצעיים והדיסטליים של המעי הגס כדי לקבל ציון כולל עבור כל חיה. לאחר מכן מחושבים הציונים הממוצעים של כל קבוצה.
