$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. בידוד מונוציטים אנושיים והתמיינות למקרופאגים
- להשיג דם נוגד קרישה מאנשים בריאים ללא זיהוי בבנק דם אזורי ולבודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) כמצוין להלן.
הערה: בצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה. יש להשתמש בצינורות סטריליים בלבד וללבוש כפפות. יש להוסיף 10% אקונומיקה לכל המוצרים הקשורים לדם בעת השלכתכם. ניתן להשתמש במי מלח סטריליים חוצצי פוספט (PBS) (1x) או במי מלח חוצצי פוספט של דולבקו (DPBS) (ללא Ca2+ ו- Mg2+) לסירוגין.
- הכינו את מאגר הדילול: הוסיפו PBS סטרילי אחד עם 2% סרום בקר עוברי (FBS) ו-0.5 מילימטר חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA).
- הכן את מדיום התרבית: תוספת RPMI-1640 בינוני עם FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM), ופניצילין/סטרפטומיצין (50 יב"ל/50 מיקרוגרם/מ"ל)
- קירור מראש של מאגר הריצה (Table of Materials) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- לדלל דם שלם עם שני כרכים של חיץ דילול. באמצעות צינור סרולוגי, להעביר 15 מ"ל של הדם נוגד קרישה לצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של חיץ דילול. מערבבים בעדינות בהיפוך.
- עבור כל 10 מ"ל של דם שלם או 30 מ"ל של דם מדולל, להוסיף 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות צינור ריק 50 מ"ל.
- שכב את מדיום שיפוע הצפיפות משלב 1.1.5 עם 30 מ"ל של דם מדולל לאט ובהתמדה באמצעות פיפט סרולוגי 25 מ"ל. שמור את קצה הצינור כנגד דופן הצינור ואת הצינור בזווית מוטה.
- מעבירים בזהירות את הצינורות לצנטריפוגת דלי מתנדנדת. הימנעו מלהפריע לשני השלבים. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 25 דקות עם האצה והאטה להגדיר את הערך המינימלי.
- בזהירות להסיר את שכבת פלזמה העליון (ברור) באמצעות צינור 10 מ"ל ולהשליך אותו במיכל עם אקונומיקה (10%).
- אספו את השכבה הבין-פאזית (הלבנה) של תאי הדם החד-גרעיניים ההיקפיים (PBMCs, איור 1) עם צינור של 10 מ"ל והעבירו לצינור טרי של 50 מ"ל. שלב את השכבה הלבנה מצינורות שונים של אותו תורם בצינור 50 מ"ל עד 30 מ"ל.
- הביאו כל צינור לנפח כולל של 50 מ"ל עם חיץ הדילול משלב 1.1.1 וצנטריפוגה ב-300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוציאו את הסופרנאטנט עם צינור של 10 מ"ל והשליכו אותו למיכל עם אקונומיקה (10%).
- השהה מחדש כל כדור תא ב- 1 מ"ל של מאגר הריצה המקורר מראש משלב 1.1.3 באמצעות מיקרופיפטה p1000. שלב מתלי תאים מאותו תורם בצינור חדש של 15 מ"ל. הביאו את הנפח של כל צינור ל-15 מ"ל עם חיץ ריצה מקורר מראש וערבבו היטב בהיפוך.
- קח aliquot 20 μL של תרחיף התא משלב 1.1.11 והכן דילול 1:100 באמצעות PBS סטרילי 1x. קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
- צנטריפוגה את מתלה התא משלב 1.1.11 ב 300 x גרם ו 4 ° C במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant עם pipet 10 מ"ל. במידת הצורך, השתמשו במיקרופיפטה p200 כדי להסיר את הסופרנאטנט לחלוטין.
- השהה מחדש את מרכזיות ה- PBMC המבודדות ב- 80 μL של מאגר הפעלה MACS מקורר מראש עבור כל 1 x 107 תאים, והוסף עד למקסימום של 800 μL של המאגר.
- הוסף 20 μL של CD14 MicroBeads אנטי אנושיים לכל 1 x 107 תאים או עד 100 μL לכל דגימת דם (~ 100 מ"ל של דם לא מדולל). מערבבים היטב בהיפוך ומניחים על מסובב צינור למשך 20 דקות עם ערבוב רציף ב-4°C.
- הסר את הדגימות ממסובב הצינור, הוסף 10 מ"ל של חיץ ריצה מקורר מראש לכל צינור, וצנטריפוגה ב 300 x g (תאוצה = 5, האטה = 5) ו 4 ° C במשך 10 דקות.
- הסר את supernatant עם צינור 10 מ"ל והשהה מחדש עד 1 x 108 תאים ב 500 μL של חיץ ריצה מקורר מראש (2 x 108/מ"ל).
- בצע בידוד של תאים חיוביים ל- CD14 על ידי מיון תאים מגנטיים באמצעות מערכת ידנית או אוטומטית (רשימת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
- קח aliquot 20 μL של תרחיף התא משלב 1.1.18 לאחר בחירה חיובית CD14 והכן דילול 1:100 באמצעות PBS סטרילי 1x. קבע את מספר התא על ידי ספירת התאים על המוציטומטר.
- צנטריפוגה את התאים החיוביים ל- CD14 ב- 300 x g ו- RT למשך 10 דקות. הסר את הסופרנאטנט באמצעות צינור 10 מ"ל או מערכת ואקום.
- השהה מחדש את כדורית התא משלב 1.1.20 בתווך תרבית שחומם מראש משלב 1.1.2 לצפיפות תאים סופית של 1 x 107 תאים/מ"ל.
- זרעו את המונוציטים המבודדים החיוביים ל- CD14 בצפיפות תאים של 5 x 106 תאים.
- על צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ, יש להוסיף 10 מ"ל מדיום תרבית משלב 1.1.2 בתוספת גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) בנפח 50 נ"ג/מ"ל
.
- הוסף 0.5 מ"ל של תרחיף התא משלב 1.1.21 למדיום התרבית טיפה וסובב בעדינות את הצלחת. לדגור על תאים באינקובטור תרבית רקמה לח (37°C, 5% CO2) למשך הלילה.
- למחרת, שאפו את התווך באמצעות מערכת ואקום כדי להסיר תאים שלא נצמדו בן לילה. הוסף 10 מ"ל של תרבית טרייה בתוספת GM-CSF בינונית (50 ננוגרם/מ"ל) ודגר על תאים באינקובטור תרביות רקמה לח (37°C, 5% CO2) למשך 7 ימים כדי לאפשר התמיינות מלאה (ראו איור 2A להופעת מונוציטים CD14+ בשלבים שונים של התמיינות ב-GM-CSF). החליפו את מדיום התרבית כל 2-3 ימים והוסיפו GM-CSF טרי (50 ננוגרם/מ"ל) בכל פעם.
2. הכנת רכיבי אלקטרופורציה
הערה: פרוטוקול זה מיועד לקצה 10 μL-Neon (טבלת חומרים). עבור כל טרנספקציה, השתמש 1-2 x 105 תאים. מומלץ לזרוע תאים נגועים על צלחת 48 באר או צלחת 8 תאים היטב (10 μL תאים נגועים לכל באר). ניתן להשתמש ב-DPBS סטרילי אחד (ללא Ca2+ ו-Mg2+) במקום PBS.
- ביום השביעי, הכינו מדיום ללא אנטיביוטיקה על ידי השלמת מדיום RPMI-1640 עם FBS (10% (v/v)) וגלוטמקס (2 mM).
- יש להניח מדיום RPMI-1640 ללא סרום, תמיסת טריפסין-EDTA (0.25%), PBS סטרילי אחד (ללא Ca2+ ו-Mg2+), ומדיום תרבית שלם משלב 1.1.2 באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
- אם משתמשים בכלים בעלי תחתית זכוכית (למיקרוסקופ קונפוקלי) מצפים את הכלים בפולי-D-ליזין הידרוברומיד.
- מצפים צלחת בעלת 8 תאים היטב עם 200 μL של פולי-D-ליזין הידרוברומיד (0.1 מ"ג/מ"ל ב-PBS סטרילי אחד) ודגרים במשך 5 דקות ב-RT.
- שאפו את תמיסת פולי-D-ליזין ושטפו את הכוס פעם אחת עם PBS סטרילי אחד. שאפו את PBS והמשיכו לשלב 2.4.
- הוסף 200 μL של מדיום ללא אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת 48 באר או 8 צלחת תאים היטב מראש לדגור באינקובטור תרבית רקמה לח (37 ° C, 5% CO2) עד מוכן צלחת צלחת התאים נגועים.
3. הכנת תאים לאלקטרופורציה
הערה: תפוקת MDM מצלחת של 10 ס"מ בתום תקופת התמיינות של 7 ימים היא בערך 1.5 x 106 תאים. ניתן להשתמש ב- DPBS סטרילי אחד (ללא Ca2+ ו- Mg2+) במקום PBS. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כך שרוב המקרופאגים מנותקים מהצלחת תוך שמירה על כדאיות התא ושלמותו. קשה לנתק MDM מלוחיות תרבית תאים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לבצע שלבים 3.2 ו 3.3 פעמיים כדי לנתק את התאים. ודא שכל זמן דגירה עם טריפסין-EDTA (0.25%) אינו עולה על 5 דקות.
- שאפו את המדיה ממקרופאגים ממוינים לחלוטין על כלים בקוטר 10 ס"מ ושטפו את שכבת התא במדיום RPMI-1640 חם ללא סרום. הקפד להסיר לחלוטין את המדיום.
- קצרו את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה (0.25%) לכל צלחת של 10 ס"מ ודגרו באינקובטור תרבית רקמה לח (37°C, 5% CO2) למשך 5 דקות.
- השלם את ניתוק התאים על-ידי פיטיפציה עדינה של תמיסת טריפסין-EDTA (0.25%) מעלה ומטה על פני כל שטח הצלחת באמצעות מיקרופיפטה p1000. העבר את תרחיף התא לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית שלם חם משלב 1.1.2.
- קחו את המנה למיקרוסקופ שדה בהיר ובדקו אם יש ניתוק תאים בשדות ראייה שונים. אם יש כמות ניכרת של תאים עדיין מחוברים, חזור על שלבים 3.2-3.3.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
- שאפו את המדיום והשעו מחדש את התאים ב 10 מ"ל של PBS סטרילי 1x שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. קח aliquot 20 μL כדי לקבוע את מספר התא באמצעות hemocytometer.
- קח 1-2 x 105 תאים לכל טרנספקציה מיועדת ומניחים בצינור 15 מ"ל. מביאים לנפח סופי של 15 מ"ל עם PBS סטרילי 1x שחומם מראש. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
- שאפו את PBS ואת הצנטריפוגה פעם נוספת למשך דקה אחת ב 250 x גרם. הסר כל שארית PBS מכדורית התא באמצעות מיקרופיפטה p200.
4. נוקלאופקציה של רכיבי BiFC קספז למקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוצע באמצעות מערכת העברת ניאון (טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאר את השלבים להעברה של 1-2 x 105 תאים באמצעות קצה ניאון של 10 μL (טבלת חומרים). אם אתם משתמשים בקצה ניאון של 100 μL, הגדילו בהתאם. הימנע מחשיפת תאים למאגר R, תרחיף למשך יותר מ-15 דקות, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בכדאיות התא וביעילות ההעברה.
- לדלל את פלסמיד הכתב (כלומר, mCherry או dsRedmito ב 100 ng / μL) במים נטולי nuclease או 0.5x TE buffer כדי להמחיש את התאים הנגועים.
- יש לדלל את פלסמידים BiFC של קספז לריכוז מתאים במים נטולי נוקלאז או בחיץ TE של 0.5x, כך שהנפח הכולל של פלסמידים לא יעלה על 30% מנפח הטרנספקציה הכולל של 10 μL (כלומר, 300 ng/μL של C1 Pro-VC ו-300 ng/μL של C1 Pro-VN).
- הכינו מיקרו-צינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל לכל טרנספקציה מיועדת והוסיפו את הכמות המתאימה של פלסמיד כתב (כלומר, 50 ננוגרם או 0.5 מיקרוליטר) ופלסמידים BiFC קספז (כלומר, 300 ננוגרם או 1 מיקרוליטר של C1 Pro-VC ו-300 ננוגרם או 1 מיקרוליטר של מקטע C1 Pro-VN). שמור את המיקרו-צינורות במכסה המנוע בכל עת.
- מניחים את תחנת הפיפטה, המכשיר, הטיפים, צינורות האלקטרופורציה והפיפטה במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית.
הערה: תחנת הפיפטה, המכשיר, הטיפים, צינורות האלקטרופורציה והפיפטה כלולים במערכת הטרנספקציה של ניאון.
- חבר את מחבר המתח הגבוה והחיישן בתחנת פיפטה ליציאות האחוריות במכשיר בהתאם להוראות היצרן. שמור את תחנת פיפטה קרוב למכשיר.
- חבר את כבל החשמל לכניסת החשמל האחורית והמשך לחבר את ההתקן לשקע החשמל. לחץ על מתג ההפעלה כדי להפעיל את ההתקן.
- הזן את פרמטרי ההעברה במסך ההפעלה המוצג כאשר ההתקן מופעל ומחובר כראוי. לחץ על מתח, הזן 1000 ולחץ על דוןe כדי להגדיר את המתח ל- 1000 V. לחץ על רוחב, הזן 40 ולחץ על בוצע כדי להגדיר את משך הפולס ל- 40 אלפיות השנייה. לבסוף, לחץ על # פולסים, הזן 2 ולחץ על בוצע כדי להגדיר את מספר הפולסים החשמליים ל -2.
- קח את אחד מצינורות האלקטרופורציה (המסופקים בערכה) ומלא אותו ב -3 מ"ל של חיץ אלקטרוליטי E (עבור קצוות 10 μL ומסופק בערכה) ב- RT. הכנס את צינור האלקטרופורציה למחזיק פיפטה בתחנת פיפטה. ודא שהאלקטרודה בצד הצינור פונה פנימה ושצליל נקישה נשמע בעת החדרת הצינור.
- קח את גלולת התא משלב 3.8 והוסף 10 μL של חיץ R מתלה שחומם מראש (מסופק בערכה) עבור כל 1-2 x 105 תאים. מערבבים בעדינות עם מיקרופיפטה p20. הוסף 10 μL של תרחיף התא לכל צינור שהוגדר בשלב 4.3 וערבב בעדינות עם מיקרופיפטה p20.
- קח את פיפטה והכנס טיפ על ידי לחיצה על כפתור לחיצה על התחנה השנייה. ודא שהמהדק מרים לחלוטין את גזע ההרכבה של הבוכנה בקצה ושלא נצפה רווח בראש העליון של הפיפטה.
- כדי לשאוב את הדגימה, לחץ על כפתור הלחיצה על פיפטה עד התחנה הראשונה וטבול אותה בצינור הראשון המכיל את תערובת ה- DNA התא / פלסמיד. שאפו באיטיות את התערובת לתוך קצה הפיפטה.
הערה: הימנע מבועות אוויר מכיוון שהן יכולות לגרום לקשת במהלך התחשמלות, ואם זוהו על ידי המכשיר, יכולות למנוע את העברת הפולס החשמלי. אם נצפו בועות אוויר, שחררו את התוכן לתוך הצינור ונסו לשאוף שוב.
- הכנס את פיפטה עם המדגם בזהירות רבה לתוך מחזיק פיפטה. ודא שהפיפטה לוחצת ושהיא ממוקמת כראוי.
- לחץ על התחל במסך המגע והמתן עד לאספקת הפולסים החשמליים. הודעה על המסך תציין השלמה.
- הסר באיטיות את פיפטה מהתחנה והוסף מיד את תרחיף התאים הנגוע לבאר המתאימה עם מדיום חומם מראש ללא אנטיביוטיקה משלב 2.4 על ידי לחיצה איטית על הלחצן לתחנה הראשונה.
הערה: קצה זה ניתן לעשות שימוש חוזר עד שלוש פעמים עבור אותו פלסמיד; אחרת, השליכו אותו למיכל פסולת מסוכנת ביולוגית על ידי לחיצה על כפתור לחיצה לתחנה השנייה.
- חזור על שלבים 4.10-4.14 עבור כל צינור המכיל תערובת DNA תאית/פלסמידית.
- נענעו בעדינות את הצלחת עם תאים נגועים ודגרו במשך 1-3 שעות באינקובטור תרבית רקמה לח (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
- הוסף לכל באר 200 μL של מדיום תרבית שחומם מראש (מדיום שלם) משלב 1.1.2. מניחים את המנה באינקובטור תרבית הרקמה הלח (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) שוב. יש להמתין לפחות 24 שעות לביטוי גנים.
- למחרת, בדקו את כדאיות התא ואת יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
- הפעל את המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי ואת קופסת מקור האור הפלואורסצנטי בהתאם להוראות היצרן והנח את צלחת התרבית על במת המיקרוסקופ.
- בחר במטרה 10x או 20x ובמסנן 568 nm (RFP).
- כדי להעריך את כדאיות התא, לחץ על לחצן נורית LED (TL) כדי להציג באופן חזותי את כל התאים בשדה שנבחר. תוך כדי התבוננות בעינית המיקרוסקופ, סובב את ידית המיקוד עד לצפייה בתאים ובדוק אם יש חיבור תאים בשדה שנבחר.
הערה: תאים המחוברים במלואם מייצגים את התאים בני קיימא בעוד תאים צפים מייצגים תאים שאינם בני קיימא. אם המפגש של הבאר גבוה, נוכחותם של תאים שאינם מחוברים יכולה להיות תוצאה של הערכת יתר של מספר התאים ולא תוצאה של כדאיות נמוכה. עם זאת, מפגש נמוך המלווה בתכולה גבוהה של תאים צפים מסמל כדאיות נמוכה שעלולה לנבוע מקשת במהלך אלקטרופורציה, רעילות פלסמיד, או חשיפת יתר לחיץ R תרחיף. אין להשתמש בבארות המציגות את ההתנהגות האחרונה.
- כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה, התמקדו בתאים בשדה שנבחר תחת האור המועבר כמתואר לעיל. ספירת מספר התאים הכולל בשדה שנבחר. כאשר נורית ה-LED של האור המשודר (TL) כבויה, לחץ על לחצן נורית ה-LED של האור המוחזר (RL) כדי להפעיל.
- התמקדו בגן המדווח פלואורסצנטי (תאים אדומים) וספרו את המספר הכולל של תאים פלואורסצנטיים אדומים. חזור על שלבים אלה (4.18.4-4.18.5) עבור לפחות שני שדות נוספים לכל באר.
5. טיפול ב- MDM נגוע וקספז רכישת נתוני BiFC
הערה: אם מתכננים לדמיין את התאים באמצעות אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי, מומלץ לטפל ב- qVD-OPh (20 מיקרומטר) במשך שעה אחת לפני הטיפול בגירוי שנבחר כדי למנוע מוות תאי תלוי קספאז (בעיקר אפופטוזיס). זה משמש בהדמיה כדי למנוע תאים להתרומם עקב אפופטוזיס, מה שהופך אותם מאוד קשה לדמיין כפי שהם נעים מחוץ למישור המוקד. שים לב שגיוס קספז לפלטפורמת ההפעלה ולקספז BiFC המשויך אינו תלוי בפעילות הקטליטית של הקספאז, וכתוצאה מכך, עיכוב קספז לא ישפיע על שלב זה.
- לטפל עם גירוי נבחר כ 24 שעות לאחר transfection ולדגור כל עוד יש צורך עבור כל תרופה.
- הכן את מדיום ההדמיה על ידי השלמת מדיום התרבית משלב 1.1.2 עם Hepes (20 mM, pH 7.2-7.5) ו 2-mercaptoethanol (55 μM).
- מוסיפים את ריכוז הגירוי הרצוי למדיום ההדמיה המחומם מראש ומערבבים בעדינות.
- הסר את המדיה מהתאים בזהירות עם מיקרופיפטה p1000 והוסף 500 μL של תמיסת הגירוי משלב 5.1.2 במורד הצד של הבאר.
- כדי להפעיל בארות בקרה לא מטופלות, הוסף אמצעי הדמיה ללא הגירוי.
- לדגור על התאים באינקובטור תרבית רקמה לח (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כל עוד מצוין עבור כל טיפול.
- דמיינו את התאים באמצעות אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי.
- הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי, בהתאם להוראות היצרן.
- בחר את המטרה 10x או 20x ומקם את צלחת התרבית על במת המיקרוסקופ.
- באמצעות עינית המיקרוסקופ, מצאו תאים מתחת למסנן 568 ננומטר והתמקדו בתאים המבטאים את כתב dsRedmito/mCherry (תאים אדומים).
- ספור את כל התאים האדומים בשדה הראייה ורשום את המספר.
- באותו שדה ראייה, שנו למסנני 488 או 512 (GFP או YFP), המשיכו לספור את מספר התאים האדומים שהם גם ירוקים (Venus-positive או BiFC-positive), ורשמו את המספר.
- ספור לפחות 100 dsRedmito/mCherry -תאים חיוביים משלושה שדות ראייה נפרדים לפחות.
