מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

תקציר

מקור: Azriel, S., et al. מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות בין מיקרוביוטה למארח. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת הניסוי

1. ייצור מכשיר תרבית איברי המעי (3 ימים)
   1. באמצעות מדפסת תלת ממד, הדפס את תבניות הפלסטיק לשימוש חוזר עבור התקן תרבית האיברים (למכשיר יש 6 בארות, עם 24 חורים קטנים וגדולים, ולמכסה כיסוי המכשיר).
      הערה: תבניות פלסטיק אלה עשויות לשמש לייצור מכשירים רבים.
   2. הכנס את המחטים הקהות (22 גרם ו-18 גרם) למיקום המתאים בתוך תבנית המכשיר ויצק כ-20 גרם תערובת פולידימתילסילוקסאן (PDMS) (יחס משקל 1:10, בסיס לזרז) עבור סט אחד של המכשיר והמכסה.
   3. הניחו את התבניות בתא ואקום למשך 30 דקות, כדי להסיר בועות אוויר מתערובת PDMS.
   4. יש לדגור על התבניות בטמפרטורה של 55°C למשך הלילה, להשלמת פילמור PDMS.
   5. כאשר ה-PDMS מוגדר, הוציאו את המחטים מהתבנית ושחררו בזהירות את מכשיר התרבית והמכסה מתבניות הפלסטיק.
   6. הסר שאריות PDMS ממתאר הבאר באמצעות להב כירורגי. חבר את התקן PDMS ואת מכסה המכשיר לזכוכית כיסוי (שקופיות מיקרו בגודל 75 מ"מ x 50 מ"מ) באמצעות דבק סיליקון לא רעיל והשאר את החלקים להתייצבות למשך הלילה (החל את הדבק על הצד החלק של המכשיר).
   7. הכנס שתים עשרה מחטים של 22 גרם עבור לומן ושתים עשרה מחטים של 18 גרם עבור הבאר. תקנו את כל המחטים במקומן באמצעות סיליקון ותנו להן לשקוע למשך הלילה. הכנס שתי מחטים של 18 גרם למכסה הכיסוי לזרימת אוויר תקינה פנימה והחוצה ממכשיר תרבית איברי המעי.
   8. בדוק את כל המחטים עבור נזילות באמצעות מזרק מלא מים. בדקו שאין דליפה מהבארות על ידי מילוי הבארות במים.
   9. הניחו שני קשרים כירורגיים על כל מחט 22 גרם שתחובר למעי הגס. מניחים את המכשיר ואת המכסה בשקית נייר autoclave ולעקר autoclave.
2. מדיום תרבות (0.5 שעות)
   1. במכסה מנוע ביולוגי, מערבבים את הדברים הבאים (בצינור של 50 מ"ל): 37 מ"ל של מדיום Dulbecco של Iscove (IMDM), 10 מ"ל של תחליף סרום KSR, 1 מ"ל של תוסף B27, 0.5 מ"ל של תוסף N2, 0.5 מ"ל של 1 M HEPES buffer, ו 0.5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות.
   2. סנן ואחסן את המדיום המלא ב- 4°C.
3. אבובים והכנת כלי ניתוח
   1. חתכו את אורך הצינורות המתאים ללומן הקלט, הכניסו היטב, פלטו לומן והפיקו היטב (12 צינורות קצרים ו-12 צינורות ארוכים). חבר מתאם מתאים לכל צד של הצינור.
   2. הכינו את כלי הניתוח: מספריים ישרים, מלקחיים דקים פי 4 ומלקחיים חדים פי 2.
   3. הניחו את הצינורות ואת כלי הניתוח בשקית נייר אוטוקלאבית ועיקרו אותם באמצעות אוטוקלאב.
4. הכן את הקלט הלומינלי (גירוי רצוי - חיידקים, צואה, תרופות וכו ').
   1. לפני הניסוי, לקבוע את העומס החיידקי של תרבית חיידקים, על ידי דילול סדרתי, ותרבית בתנאים אירוביים ו / או אנאירוביים.
   2. לאחר חישוב העומס החיידקי, מדללים את תרביות החיידקים בתווך תרבית רקמה סטרילי כדי לקבל את ריכוז החיידקים הנדרש. עבור דגימות צואה, סנן באמצעות מסננת 100 מיקרומטר .
      הערה: לגירוי לא בקטריאלי (תרופות, מטבוליטים וכו'), יש לדלל את החומר לריכוז הנדרש באמצעות מדיום תרבית המעיים.

2. הכנת הניסוי

1. בתוך אינקובטור תרבית האיברים, הפעל את יחידת החימום והגדר אותה ל -37 מעלות צלזיוס.
2. הגדר את המשאבות כמו גם את מזרקי הקלט והפלט.
3. קלט בינוני של תרבית רקמה
   1. במכסה מנוע זרימה ביולוגי או למינרי, מלא את מזרקי הקלט היטב במדיום תרבית שלם. הנפח הסופי תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה; בדרך כלל 1 מ"ל / שעה בתוספת תווך נוסף לטיהור.
   2. חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם Luer-lock. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.
   3. לטהר את מזרקי הקלט. יש לוודא שמדיום הבאר זורם החוצה מכל הצינורות לתוך פסולת.
4. קלט לומינלי
   1. מלא את מזרקי הקלט הלומינליים בטיפול גירוי (חיידקים, תרופות וכו '). הנפח תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה (בדרך כלל 30 μL/h בתוספת תווך נוסף לטיהור).
   2. חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם Luer-lock. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.
   3. לטהר מזרקי קלט. ודא שהגירוי זורם מכל הצינורות לתוך פסולת. היזהרו שלא לזהם את הגירויים השונים.
5. פלטי
   1. הניחו את המזרקים הריקים במשאבות מזרקי הפלט (כוונו את מצב המשאבה ל'נסיגה').
6. הגדרת המכשיר
   1. הגדר את הרגולטור השולט בקצב הזרימה של תערובת הגז (95% O₂ + 5% CO₂) לזרימה עדינה ומינימלית.
   2. בדוק את המכשיר במכסה מנוע למינרי.
   3. לשטוף את המחטים של המכשיר עם IMDM סטרילי כדי לשטוף את המחטים.
   4. הוסף 500 μL של מדיום תרבית סטרילית לכל באר של המכשיר.
7. הכנה לדיסקציה של רקמות
   1. שים את כלי הניתוח הסטריליים בתוך מכסה המנוע הלמינרי.
   2. ממלאים מזרק 10 מ"ל ב- IMDM סטרילי ומחברים מחט סטרילית (אוטוקלאבית) 22 G קהה לשטיפה של המעי הגס.

3. תרביות איברים

1. הקרבת עכברים ונתיחת רקמות
   1. במכסה מנוע למינרי, הקריבו עכברים בני 12 עד 14 יום על ידי עריפת ראש. רססו את העכברים באתנול 70% והניחו את העכברים על צלחת פלסטיק.
   2. בעזרת מספריים ומלקחיים חדים, מנתחים את העכבר ומוציאים את מערכת העיכול מהקיבה לפי הטבעת על ידי חיתוך כל רקמות השומן והחיבור. חותכים את המעי הגס ומניחים אותו על צלחת חדשה.
      הערה: יש למזער את המגע עם רקמת המעי הגס. אין לגעת בחלק האמצעי של רקמת המעי הגס. החזיקו את הרקמה בעדינות ורק בשולי הרקמה.
2. יש לשטוף ולשטוף את המעי הגס
   1. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לשטוף בעדינות את תוכן המעי הגס עם IMDM סטרילי (לתוך הצד הפרוקסימלי) עם מזרק מוכן 10 מ"ל (שלב 2.7.2). לאחר הסרת הצואה מרקמת המעי, מניחים את המעי הגס בצלחת חדשה 6 בארות מלאה 0.5 מ"ל של IMDM סטרילי.
3. חיבור המעי הגס להתקן
   1. קח את הרקמה, חבר אותה בזהירות למחט 22 גרם, ולעשות קשר הדוק עם שני החוטים. בשלב זה, הכרחי לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס לזרימת לומן (פרוקסימלי = קלט, דיסטלי = פלט). חזור על שלבים 3.2-3.3 עבור כל 6 הרקמות.
   2. ודא שמנעולי מחט הקלט ריקים מהמדיום. אם לא, רוקנו אותם. הוסף גירויים למנעול מחט הקלט Luer (כדי למנוע כניסה של בועות אוויר לתוך לומן). חזור על שלב זה עבור כל נקודתיים עם הגירוי המתאים.
   3. בדוק שכל הרקמות מחוברות והנח את מכסה הכיסוי על גבי המכשיר.
4. חיבור מכשיר תרבית האיברים למשאבות
   1. הכניסו את המכשיר לתא מבוקר טמפרטורה שחומם מראש (37°C).
5. חיבור זרימת גז
   1. חבר את מתאם הגז למכסה הכיסוי באמצעות מחט הקלט המתאימה.
   2. חבר את צינורות הקלט והפלט להתקן.
      הערה: חבר את צד המעי הגס הפרוקסימלי לאמבטיות הקלט.
6. לטהר את לומן עם קלט גירוי.
   1. הזרימו בעדינות גירוי לומינלי דרך המעיים וודאו זרימה בינונית בצינורות הפלט.
   2. לשטוף מדיום חיצוני.
   3. שטפו את התווך החיצוני 3 פעמים (כוונו את המשאבות בקצב של 600 מיקרוליטר/דקה הן לכניסה והן ליציאה היטב). כל שטיפה אורכת דקה (מתחילים בריקון הבאר).
7. התחל את הניסוי.
   1. הפעל את המשאבות בקצב הבא:
      קצב זרימה: לומן: קלט- 30 μL/h, פלט- 35 μL/h
      תווך חיצוני: קלט- 1000 μL/h, פלט- 950 μL/h
      הערה: זמן הניסוי יכול לנוע בין 30 דקות ל-24 שעות.
8. סוף הניסוי (עד 24 שעות לתרביות איברי המעי הגס)
   1. נתק את כל הצינורות מהמכשיר.
   2. נתקו את הרקמות מהמחטים והמשיכו לקריאות הרצויות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר
מחט קהה 18 מד	מקמסטר	75165a754
מחט קהה 22 מד	מקמסטר	75165a758
חומר איטום דביק 100% סיליקון	DAP	688
מייבש ואקום מעוקב VDC-21+ 2 מדפים		AAAD4021
מגלשת זכוכית בעובי 1 מ"מ	קורנינג	2947-75X50
מיני אינקובטור im-10		AAH24315K
משאבת ואקום MPC 301E		VI-412711
תקעי צימוד צינור סיבוב מהיר מפלסטיק	מקמסטר	51525ג121
שקעי צימוד צינור סיבוב מהיר מפלסטיק	מקמסטר	52525K211
Sylgard 184 אלסטומר סיליקון	דאו		פולידימתילסילוקסן, PDMS
אבובים	מקמסטר	6516T11
Zortrax M200	זורטרקס		Zortrax Z-SUITE, אוטודסק פיוז'ן 360
Zortrax M200 חומרים: z-ultrat	זורטרקס
בינוני
תוסף B27 (50x), T ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044
מדיום Dulbecco של Iscove עם פנול אדום (1x)	תרמו פישר סיינטיפיק	12440061
חיץ HEPES (1M)	תרמו פישר סיינטיפיק	15630056
סרום נוק-אאוט	תרמו פישר סיינטיפיק	10828028
תוסף N2 (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	A1370701
חומצת אמינו לא חיונית (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	11140035
כלי ניתוח
מספריים גדולים	אסלטק	11-00-10
מלקחיים חדים	פ.ס.ט	11297-10
חוט כירורגי קלוע משי	SMI	8010ז
מספריים ישרים	פ.ס.ט	14091-09
מלקחיים דקים	פ.ס.ט	11051-10
מערכת איברים
0.1 מיקרומטר מסנן	גן חיים
0.22 מיקרומטר מסנן	גן חיים
5 מ"ל מזרק Luer-Lock	ב-ד	309649
מיקרוסקופ סטריאו Greenough	ZEISS	סטמי 305
מחזור מחמם אוויר מדויק "CUBE"		קיוב-2-LIS
משאבת מזרק	ניו עידן משאבה מערכות Inc	NEP-NE-1600-EM