כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת WS-CM
- צור מדיום ממוזג עשן שלם (WS-CM) כפי שתואר קודם לכן.
- הכן WS-CM על ידי העברת עשן מארבע סיגריות ייחוס 3R4F דרך Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני ללא פנול אדום באמצעות משטר העישון הבא: 35-60-2, נפח נשיפה במ"ל, מרווח נשיפה בשנייה ומשך נשיפה בשניות, בהתאמה. כל תכשיר מייצר דגימה של 20 מ"ל.
- שפופרות תווית עם תאריך, שעה שהושלמה ושם ומספר סיגריה. לאחסן את 500 μl aliquots ב -80 ° C מיד לאחר סיום העישון.
- לנתח aliquots של WS-CM קפוא כדי לקבוע את רמות ניקוטין, nitrosamines ספציפיים טבק, ופחמימנים ארומטיים polycyclic כפי שתואר לעיל.
2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים, PBMCs
- איסוף דם טרי מתורמים בריאים (שאינם צרכנים של מוצרי טבק) בידוד PBMCs מדם טרי כמתואר להלן.
- לפני הגעת שקית הדם, הצטיידו בבקבוק של 500 מ"ל, מספריים, חיץ בידוד ובמי מלח חוצצי פוספט (DPBS) (RT) של Dulbecco מוכנים במכסה מנוע של תרבית תאים ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). מאגר הבידוד חייב להיות מוגן מפני אור.
- החזיקו את שקית הדם הפוכה וחתכו את הצינור ממש מתחת למקום שבו הוא הודק והותירו לפחות 3 ס"מ של צינור.
- הסירו את הפקק מהבקבוק בנפח 500 מ"ל והחזיקו את הצינור מעל פתח הבקבוק. הרימו את שקית הדם והפכו אותה כדי לאפשר לדם לזרום בחופשיות מהשקית לתוך הבקבוק עד שהשקית מתרוקנת. אפשרו לדם לזרום אל הדופן הפנימית של הבקבוק לעומת ישר למטה כדי למנוע יצירת בועות.
- יש לשפוך את מאגר הבידוד לבקבוק ביחס של 1:5 בין מאגר הבידוד לדם. מכסים את הבקבוק בחוזקה והופכים אותו בעדינות, מקצה לקצה, 10 פעמים. השאירו את הבקבוק במכסה המנוע של תרבית התאים כדי לדגור עם אורות כבויים, למשך שעה אחת ב-RT.
- שכבה בהירה בצבע קש תצטבר מעל הדם. הסר שכבה זו באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ"ל לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. הסכום שנאסף עשוי לנוע בין 50 - 300 מ"ל, בהתאם לנושא שתרם דם.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
- שאפו את הסופרנטנט השקוף, והשאירו את הגלולה בצבע הדם הכהה. הגלולה תהיה רופפת אך צמיגית.
- פיפטה 3 מ"ל של חיץ בידוד לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל.
- לגלולה המושעה, הוסף 20 מ"ל של DPBS עבור כל 50 מ"ל של נוזל בצבע קש שנאסף בשלב 2.1.5. מערבולת כדי לערבב היטב, ולגבש את הנוזל המרחף מחדש מצינורות מרובים. נוזל זה מכיל תאי דם מרחפים.
- בעזרת צינור העברה, מעבירים 5 מ"ל של תאי הדם המרחפים ל-3 מ"ל של מאגר בידוד בשלב 2.1.8. הטו את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל המכיל את תרחיף התא לאט ובעדינות ליצירת שתי שכבות נפרדות. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 40 דקות ב RT עם האצה מינימלית וללא בלימה.
- השתמש בצינור העברה כדי להסיר את השכבה האמצעית העכורה שנוצרה (ציפוי באפי) המכילה PBMCs לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. הימנעו מציור שכבות שקופות אחרות מתחתיו. להעביר לא יותר מ 25 מ"ל לתוך כל 50 מ"ל צינור חרוט.
- הוסף 25 מ"ל של חיץ ריצה קר (או יותר כדי למלא את כל הנפח הנותר של צינור חרוטי 50 מ"ל) כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- השהה מחדש את הגלולה עם מאגר ריצה של 10 מ"ל. זה מכיל PBMCs. לספור את התאים ולהשתמש בהם מיד או להניח אותם על קרח להקפאה.
3. הקפאה והפשרה של מרכזיות
מרכזיות
- צנטריפוגה את תאי הדם החד-גרעיניים האריפריאליים (PBMCs) שנאספו בשלב 2.1.13 למשך 10 דקות ב 400 x גרם.
- מלא את מיכל ההקפאה באלכוהול איזופרופיל בהתאם להוראות היצרן.
זהירות: אלכוהול איזופרופיל הוא דליק ורעיל מאוד.
- יש להשהות מחדש את הגלולה עם RPMI 1640 בינוני (4°C) המכיל 20% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). זהו RPMI 1640 מדיום הקפאה. השהה מחדש את הגלולה עם כמות של מדיום הקפאה שיגרום לתרחיף בעל כ 5 x 107 תאים / מ"ל. מספר התאים הזמינים להקפאה ישתנה.
- מוציאים 1 מ"ל aliquots של תרחיף התא לתוך 2 מ"ל cryotubes ומניחים את cryotubes במיכל ההקפאה. הניחו את מיכל ההקפאה עם צינוריות ההקפאה במקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון O/N ולאחר מכן הסירו את צינורות ההקפאה והעבירו לאחסון במקפיא קריוגני בין -150°C ל-190°C.
- הסר את צינור ההקפאה מהאחסון הקריוגני והפשיר אותו במהירות עם תסיסה עדינה באמבט מים ב -37 מעלות צלזיוס.
- העבירו מיד את ה-PBMCs המופשרים בצינור הקריו-צינור לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל RPMI 1640 מדיום שלם (4°C) המכיל 10% FBS, 1% Pen/Strep ו-1% L-גלוטמין. התוכן של cryotube מופשר צריך להיות מועבר בהקדם האפשרי כדי להשיג כדאיות התא המקסימלית.
- צנטריפוגה של מרכזיות ב 400 x גרם במשך 10 דקות.
- להשעות את הגלולה עם 5 מ"ל RPMI 1640 להשלים בינוני ולספור את התאים.
- מדוד את כדאיות התא על-ידי שיטות מבוססות כגון שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן. בדרך כלל, כדאיות התא בשיטה זו היא כ 90 - 95%. ה-PBMCs מוכנים כעת לשימוש בניסויים.
4. צביעה תוך-תאית וציטומטריית זרימה
הערה: דילולים המפורטים כאן הם לצורך מחקר זה. ניתן להתאים את הדילולים בהתאם.
- יש לדלל את WS-CM בצלחת בעלת 96 בארות באמצעות RPMI שלם בינוני לנפח כולל של 100 מיקרוליטר/באר בריכוז של 0.3, 1.56, 3 ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של יחידות אקו-ניקוטין.
- באותה צלחת מדללים ניקוטין לריכוזים הבאים: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 ו-4000 מק"ג/מ"ל<בר/>
זהירות: ניקוטין הוא רעיל מאוד ומסוכן לסביבה.
- הוסף 100 μl של PBMCs מרחפים בתווך RPMI שלם בריכוז של 1 × 106 תאים / באר. הנפח הכולל של תאים בתוספת WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / well.
- מכסים את הצלחת ודגרים במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- שטפו את התאים ב-RT על ידי צנטריפוגה ב-300 × גרם במשך 3 דקות, תוך שאיפת הסופר-נטנט, ערבוב תחתית הצלחת כשהצלחת מכוסה ולבסוף השעיית תאים עם 200 מיקרוליטר של חיץ ריצה קר כקרח, וחזרו על שלב הכביסה פעם נוספת.
- מוסיפים 200 מיקרוליטר של סל"ד מלא לצלחת וחוזרים על שלב השטיפה פעם נוספת.
- הכינו את ריכוזי העבודה של 2 μl/ml GolgiPlug ו-10 μg/ml LPS באמצעות RPMI Complete Medium והוסיפו 200 μl לכל באר.
- יש לדגור על הצלחת במשך 6 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- בסוף שלב 9.8, שטפו את התאים עם חיץ פועל (4°C) וסובבו ב- 300 x גרם במשך 3 דקות ב- 4 °C.
- מוסיפים 100 μl של Cytofix לכל באר ודגרים במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- שטף את התאים 3 פעמים כמתואר בשלב 9.9 עם 1x Permwash (4 ° C) ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 45 μL של 1x Cytoperm לכל באר ואחריו 5 μl של כל אחד מהנוגדנים הבאים לכל באר: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. יש לדגור ב-4°C למשך 30 דקות.
- שטף את התאים פעמיים כמתואר בשלב 9.9 עם 1x Permwash (4 ° C) ופעם אחת עם מאגר פועל (4 ° C) ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
- להשעות מחדש את התאים עם 200 μl של 2% paraformaldehyde (4 ° C). להעביר את התאים לתוך 12 צינורות × 75 מ"מ, ולנתח את הדגימות על cytometer זרימה.
זהירות: Paraformaldehyde הוא קורוזיבי, רעיל מאוד, וסכנה בריאותית.
