סינתזת ביופילם חוץ גופית מאת Staphylococcus aureus

תקציר

מקור: Rana, P. S. et al., Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הכנת ביופילם במבחנה על ידי S. aureus בצלחת מרובת בארות מצופה פולי-L-ליזין. הצלחת בצורת ביופילם יכולה לשמש לניסויים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הכנת ביופילם חוץ גופי

1. השג מושבות מבודדות של S. aureus ממלאי הקפאה באמצעות טכניקת צלחת פסים על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים, כגון אגר סויה טריפטי (ראה טבלת חומרים).
2. מצפים בארות בודדות של צלחת 96 בארות עם 100 μL של 0.001% (v/v) פולי-L-ליזין (PLL) מדולל בסטרילי H₂O ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מבחינה אספטית יש לשאוף את תמיסת PLL באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום. הניחו לבארות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   הערה: כל שלבי השאיפה בפרוטוקול מבוצעים באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום, אלא אם צוין אחרת.
3. הכינו תרבית לילה על ידי חיסון מושבה של S. aureus במדיה חיונית מינימלית אלפא (MEMα) בתוספת 2% גלוקוז ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס, ניעור ב 200 סל"ד במשך 16-18 שעות.
4. לדלל את תרבית הלילה על ידי העברת 50 μL עד 5 מ"ל של MEMα טרי בתוספת 2% גלוקוז ולדגור ב 37 ° C, רועד ב 200 סל"ד, עד שלב לוגריתמי אמצעי, בדרך כלל בין צפיפות אופטית 600 (OD_600nm) של 0.5-0.8. השתמש ב- MEMα כדי לנרמל תרבית לוגריתמית בינונית ל- OD_600nm של 0.1.
5. העבר 150 μL של תרבית מנורמלת לכל באר של צלחת 96 באר שטופלה PLL. יש לדגור באופן סטטי במשך 18-20 שעות בתא לח בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: ניתן לגדל את הביופילמים גם בפורמטים אחרים, כגון שקופיות μ ערוצים (ראו טבלת חומרים).
6. שאפו את הסופרנאטנט להסיר את התאים הפלנקטוניים. שטפו בעדינות את הביומסה הנותרת עם 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. הוסף HBSS טיפה כדי למנוע הפרעה biofilm.
   הערה: בזמן שאיפת הסופרנאטנט וה-HBSS במהלך השטיפה, השאירו מספיק נוזלים (סופרנאטנט או HBSS) בבארות המכילות ביופילם, כך שהביופילם עדיין שקוע. זה מונע את השיבוש של מבנה הביופילם כאשר HBSS מתווסף טיפה כדי לשטוף את הביופילם.
7. חזור על שלב 1.6 לפחות פעמיים נוספות כדי להסיר את כל התאים הפלנקטוניים. בשלב זה, ביופילמים מוכנים לניסויים מיידיים במורד הזרם.
   הערה: אם הביופילמים אינם משמשים לניסויים בנויטרופילים, HBSS יכול להיות מוחלף במי מלח חוצצי פוספט (PBS). HBSS מועדף על פני PBS מכיוון ש- HBSS מכיל רכיבים, כולל גלוקוז, המספקים תנאים אופטימליים להפעלת נויטרופילים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD Bacto מרק סויה טריפטי	ב.ד.	DF0370-07-5	שלבו עם אגר 1.5% להכנת אגר סויה טריפטי
תחתית שקופה 96 לוחות פוליסטירן שטוחים היטב	כוכב משנה	3370
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) 1x	קורנינג סלגרו	21-022-CV	ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום
תמיסת פולי-L-ליזין	סיגמא	P4707-50ML
צלחות לבנות אטומות עם 96 בארות	בז	353296	תרבית רקמות מטופלת וצלחת שטוחה
מדיה חיונית מינימלית (MEM) אלפא 1x	גיבקו	41061-029