טכניקת מבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות חיידקים פתוגניים

תקציר

מקור: Dousha, L., et al. הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות להמופילוס אינפלואנזה. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לגירוי לימפוציטים באמצעות המופילוס אינפלואנזה (NTHi) שאינו ניתן להקלדה ולהערכת התגובה החיסונית. דגירה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) עם NTHi גורמת לתאי החיידק לעורר לימפוציטים מסוג T, מה שמוביל לייצור ציטוקינים. עם עיכוב הפרשת הציטוקינים, מבוצעת צביעה אימונופלואורסצנטית כדי לזהות את הציטוקינים התוך-תאיים שהצטברו בלימפוציטים T מגורים.

פרוטוקול

1. הכנה אנטיגנית

הערה: ניתן להשתמש בשלושה תכשירים אנטיגניים שונים כדי להעריך את התגובה החיסונית ל-Hi. אלה הם 1) מרכיב תת-תאי (בדרך כלל מדופן התא החיידקי); 2) חיידקים מומתים ומומתים; ו-3) חיידקים חיים. לקבוע את השימוש של כל תכשיר אנטיגני לפני תחילת כל הניסויים.

1. רכיבים תת-תאיים
   1. להשיג רכיבים תת-תאיים ממקורות, כולל תכשירים מסחריים, רכיבים שפותחו בתוך החברה ו/או מחוקרים אחרים.
      הערה: ניתן להשתמש ברכיבים תת-תאיים בדרך כלל מדופן התא החיידקי הכוללים חלבונים בעלי קרום חיצוני כגון P6 וליפוליגוסכריד (LOS). רכיבים תת-תאיים אלה נגזרים בדרך כלל במרכזים מיוחדים. התיאור של איך הם עשויים הוא מעבר להיקף של מאמר זה. מומלץ ליצור קשר ישיר עם מומחים בתחום זה כדי להשיג רכיבים אלה.
2. חיידקים מומתים/מומתים
   1. קבל את החיידקים מהדגימה המתאימה (למשל, כיח או ברונכוסקופיה). אשר את הזן כ- H. influenzae באמצעות מעבדה מיקרוביולוגית מתאימה. בצע הקלדה של דגימות H. influenzae כדי לוודא שהן אינן ניתנות להקלדה (NTHi, על ידי מעבדה מיקרוביולוגית מומחית).
   2. כדי לקבל אנטיגן מייצג, השתמש במספר זני NTHi (לפחות 5, כל אחד בערך באותה כמות) כדי ליצור אנטיגן מאוגם. אחסנו את הזנים בטמפרטורה של -70°C בציר גליצרול בצינורות מיקרוצנטריפוגה.
      הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בעשרה זנים שונים.
   3. הפשירו את הזנים (צינור מיקרוצנטריפוגה אחד בכל פעם) על צלחות אגר שוקולד וגדלו בן לילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2. הוסף את החיידקים ל 500 μL של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ושטוף אותם פעמיים (סחרור ב 300 x גרם במשך 5 דקות). השתמש בתקן MacFarland או ספקטרופוטומטר כדי להתאים את NTHi לריכוז של 10⁸ מ"ל (באמצעות מיכל 5 מ"ל או שווה ערך).
   4. מחממים להשבית את החיידקים על ידי הצבתם באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   5. סוניק את החיידקים באמצעות הגדרת סוניקציה רציפה במהירות טווח נמוכה עד בינונית למשך 30 שניות.
   6. Aliquot את נפח הדגימות המתאים לתוך צינורות microcentrifuge. עבור מדגם של 10⁸ מ"ל, להשתמש aliquots של 50 μL (כלומר, 20 דגימות לכל מ"ל), ולהקפיא אותם ב -70 ° C עד הצורך.
3. חיידקים חיים
   1. ראשית, אפיין חיידקים חיים כפי שהוזכר בשלב 1.2.1. השתמשו בזן אחד מאופיין היטב. ודאו שהזן מאוחסן גם בציר גליצרול בטמפרטורה של -70°C כעתודה.
   2. לגדל את החיידקים על מדיה מועשרת כגון צלחות אגר שוקולד או בציר.
      1. כדי להשתמש בצלחות אגר שוקולד, להפיץ את החיידקים במשך מינימום של כל 3-4 ימים עם מפזרים סטריליים.
      2. לחלופין, השתמשו בציר עירוי לב מוחי (BHI) המועשר בגורמים X (hemin) ו-V (β-nicotinamide adenine dinucleotide) כדי לגדל את החיידקים. יש לחסן NTHi מצלחות לילה במרק BHI במינון 5-10 מ"ל בתוספת האמין ואדנין די-נוקלאוטיד β-ניקוטינאמיד (שניהם במינון 10 מיקרוגרם/מ"ל) ובתרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור 5% CO₂.
         הערה: יש לזה יתרון של יכולת שחזור, ספירת יחידות יוצרות מושבה גבוהה יותר (CFU), וכל החיידקים נמצאים בשלב דומה של צמיחת עצים (על צלחות, הכדאיות החיידקית יכולה להיות גדולה יותר בהתאם למיקום בתרבית).
   3. השתמשו בריבוי זיהומים (MOI) של 100 חיידקים בתא אחד כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה תוך שמירה על יכולת הקיום התאית. השתמש בתקן MacFarland או בספקטרופוטומטר כדי להעריך את מספר החיידקים.
   4. ודא שהמדיה המשמשת לבדיקות NTHi חיות נקייה מכל נסיוב אנושי, מכיוון שזה יהרוג את החיידקים. דגימות נסיוב בעלי חיים (למשל, נסיוב עגל עובר) בדרך כלל אינן גורמות לבעיות.
      הערה: השתמש בשיטות המתוארות להלן כדי לנתח דגימות רקמה סטנדרטיות כגון דם היקפי, דגימות ברונכוסקופיה (במיוחד שטיפת סימפונות (BAL)) ורקמת ריאה שנכרתה. לדגור על הדגימות עם אנטיגן Hi מ 10 דקות עד 24 שעות או יותר.

2. הערכת תפקוד הלימפוציטים בדם היקפי

1. השתמש בהכנות דם שלמות או תאים חד-גרעיניים לבדיקות ציטומטריית זרימה.
2. לרכוש דגימות מכל נבדק על ידי ניקור. לאסוף 4 מ"ל של דם מווריד היקפי בצינור ליתיום הפרין ולחלק את הדגימות aliquots עבור שליטה וגירוי אנטיגן.
3. הוסף נוגדנים קוסטימולטוריים (anti-CD28 ו- CD49d, 1 μL / mL) לשתי הדגימות. הוסף NTHi לדגימת האנטיגן ודגור ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 1 שעות. להכנת NTHi שנהרג, הוסף 200 μL של האנטיגן ל -2 מ"ל דם. עבור NTHi חי, הוסף תאי NTHi חיים ב- MOI של 100:1 לתאים הלבנים (כפי שנמדד על-ידי המוציטומטר).
4. מוסיפים את החומר החוסם גולג'י Brefeldin A (10 μL/mL) לדגימות ודגרים עליהן עוד 5 שעות
   הערה: חסימת מנגנון גולג'י מונעת את ייצוא הציטוקינים אל מחוץ לתא.
5. אם משתמשים בדם שלם, ליז את אריתרוציטים עם 0.8% אמוניום כלורי להשאיר רק לויקוציטים בתמיסה. תקן את leukocytes באמצעות 500 μL של 1%-2% paraformaldehyde במשך 1 שעות.
6. לספור את התאים על ידי hemocytometer, permeabilize 10⁶ תאים עם 100 μL של 0.1% saponin במשך 15 דקות, לדגור את התאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים. לשטוף את התאים ולנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימה.
   הערה: כמות הנוגדנים המסומנים בפלואורסצנטית תהיה ספציפית לכל ציטוקין. בצע את הוראות היצרן. בדרך כלל, 10⁶ תאים ב 100 μL של תמיסה יהיה מוכתם במשך 1 שעות. רוב הנוגדנים המתקבלים מסחרית יספיקו כדי לבצע 25-100 בדיקות.
7. קבעו את שיעור התאים המגיבים לאנטיגן על-ידי חישוב אוכלוסיית הלימפוציטים הרלוונטית (התאים מגודרים על-ידי CD45, לאחר מכן על-ידי CD3, ומאוחר יותר על-ידי ביטוי CD4 או CD8) כפי שמוצג באיור 1. בצע צביעת רקע על תאים שאינם מגורים עבור כל הציטוקינים לניתוח. מסך 100,000 תאים כדי לנתח כל ציטוקין הן עבור תאים מגורים והן עבור בקרה.

תוצאות

איור 1: ייצור ציטוקינים ברקמת ריאה. תאים מנותחים תחילה עבור הביטוי שלהם של סמן לויקוציטים CD45 (A) באמצעות ציטומטריית זרימה. אוכלוסייה זו מנותחת בהמשך עבור ביטוי CD3 (B) וביטוי CD4/CD8 (C). תאי CD3 / CD4+ מוערכים לייצור ציטוקינים תוך תאיים בדגימות בקרה (D) ו- NTHi מגורה (E).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום כלורי	סיגמא אולדריץ'	213330
ברפלדין	סיגמא אולדריץ'	B6542
CD28	תרמופישר	16-0289-81
CD49d	תרמופישר	534048
ספונין	סיגמא אולדריץ'	8047152