כימות מתווכי דלקת בתאים נגועים ברקמה אנושית

Abstract

מקור: Dousha, L. et al., הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות להמופילוס אינפלואנזה.J. Vis. Exp.(2021)

סרטון זה מדגים את הכימות של מתווכי דלקת במהלך זיהום על ידי דגירה של תאי חיסון אנושיים שמקורם ברקמת ריאה אנושית עם המופילוס אינפלואנזה. ציטומטריית זרימה משמשת למדידת פלואורסצנטיות של ציטוקינים בלימפוציטים מסומנים, בקורלציה עם ייצור ציטוקינים מעודדי דלקת בתגובה לזיהום חיידקי

.

Protocol

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנה אנטיגנית

1. חיידקים חיים
   1. ראשית, לאפיין חיידקים חיים. קבל את החיידקים מהדגימה המתאימה (למשל, כיח או ברונכוסקופיה). אשר את הזן כהמופילוס אינפלואנזה באמצעות מעבדה מיקרוביולוגית מתאימה. בצע הקלדה של דגימות H. influenzae כדי לוודא שהן אינן ניתנות להקלדה (על ידי מעבדה מיקרוביולוגית מומחית). השתמשו בזן אחד מאופיין היטב. ודאו שהזן מאוחסן גם בציר גליצרול בטמפרטורה של -70°C כעתודה.
   2. לגדל את החיידקים על מדיה מועשרת כגון צלחות אגר שוקולד או בציר.
      1. כדי להשתמש בצלחות אגר שוקולד, להפיץ את החיידקים במשך מינימום של כל 3-4 ימים עם מפזרים סטריליים.
      2. לחלופין, השתמשו בציר עירוי לב מוחי (BHI) המועשר בגורמים X (hemin) ו-V (β-nicotinamide adenine dinucleotide) כדי לגדל את החיידקים. יש לחסן את המופילוס אינפלואנזה (NTHi) שאינו ניתן להקלדה מצלחות לילה במרק BHI במינון 5-10 מ"ל בתוספת האמין ואדנין די-נוקלאוטיד β-ניקוטינאמיד (שניהם 10 מיקרוגרם/מ"ל) ובתרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור_CO2 של 5% פחמן דו-חמצני.
         הערה: יש לזה יתרון של יכולת שחזור, ספירת יחידות יוצרות מושבה גבוהה יותר (CFU), וכל החיידקים נמצאים בשלב דומה של צמיחת עצים (על צלחות, הכדאיות החיידקית יכולה להיות גדולה יותר בהתאם למיקום בתרבית).
   3. השתמשו בריבוי זיהומים (MOI) של 100 חיידקים בתא אחד כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה תוך שמירה על יכולת הקיום התאית. השתמש בתקן MacFarland או בספקטרופוטומטר כדי להעריך את מספר החיידקים.
   4. ודא שהמדיה המשמשת לבדיקות NTHi חיות נקייה מכל נסיוב אנושי, מכיוון שזה יהרוג את החיידקים. דגימות נסיוב בעלי חיים (למשל, נסיוב עגל עובר) בדרך כלל אינן גורמות לבעיות.
      הערה: השתמש בשיטות המתוארות להלן כדי לנתח דגימות רקמה סטנדרטיות כגון דם היקפי, דגימות ברונכוסקופיה (במיוחד שטיפת סימפונות (BAL)) ורקמת ריאה שנכרתה. לדגור על הדגימות עם אנטיגן Hi מ 10 דקות עד 24 שעות או יותר.

2. הערכת תפקוד לימפוציטים/מתווכי דלקת ברקמת הריאה

1. בדרך כלל לא ניתן להשיג מספיק לימפוציטים מברונכוסקופיה; לכן, להשתמש ברקמת הריאה מדגימות lobectomy. אופטימיזציה של דגימות רקמת ריאה דורשת קשר הדוק עם השירות הפתולוגי האנטומי. יש לוודא שלרקמה יש שוליים של לפחות 3 ס"מ מהגידול והיא הרקמה התאית ללא אמפיזמה משמעותית (כפי שנקבע על ידי הפתולוג).
2. שברו את רקמת הריאה לתרחיף תאי לפני שניתן יהיה להשתמש בו לבדיקות ציטומטריית זרימה. לעכל את רקמת הריאה באופן כימי (למשל, עם collagenase) או לפרק אותו מכנית.
   הערה: פירוק מכני של רקמות עשוי להיות מועדף מכיוון שזה קשור לצביעת פני שטח טובה יותר של תאים (למשל, תיוג CD3/4).
   1. להשיג דגימות lobectomy מפתולוג (בדרך כלל מתקבל מחולים העוברים טיפול בסרטן ריאות). פורסים כ 20-40 גרם של הדגימה לתוך 3-5 מ"מ³ חלקים. הניחו אותם בתוך תא סטרילי של 50 μL לפני שהם מפוצלים מכנית באמצעות מפרק מתאים.
   2. לאחר פירוק רקמות, lyse את אריתרוציטים עם 10: 1 (כלומר, 5 מ"ל) של 0.8% אמוניום כלורי (150 mM אמוניום כלוריד (NH₄Cl), 1 mM סודיום ביקרבונט (NaHCO₃), ו 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה תמיסת (EDTA).
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת אוטומטית כגון Q-prep.
   3. להשהות מחדש את התאים בסל"ד סטרילי (הנפח יהיה תלוי במספרי התאים ובדרך כלל הוא 10-20 מ"ל), ולאחר מכן לסנן אותם דרך רשת ניילון סטרילית 100 מיקרומטר. ספור את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.

3. בדיקת זיהום NTHi

1. להשהות מחדש את תאי הריאה לריכוז סופי של 4 x 10⁶ תאים / מ"ל לכל צינור (דגימות בקרה ומגורה).
2. השתמש בתרחיף של 4 x 10^6-6 x 10⁶ תאים ב 1 מ"ל של RPMI עבור צינור הבקרה (שלילי). השתמש באותה כמות עבור צינור NTHi (כל דגימה נוספת יכולה לשמש כבקרה חיובית עם Staphylococcal superantigen E (SEB). להדביק את התאים בצינור NTHi ב MOI של 100 חיידקים לכל תא. שחררו את הפקק חצי סיבוב כדי לאפשר מעבר גז בצינורות.
3. הניחו את התאים במסובב צינור ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C תוך כדי סיבוב ב-12 סל"ד.
4. כדי למנוע ייצוא חוץ-תאי של ציטוקינים, יש להוסיף חוסם גולג'י (Brefeldin A) לתרחיף התא שעה לאחר הגירוי לריכוז סופי של 10 מק"ג/מ"ל. מחזירים את מתלי התאים לדגירת 16-22 שעות נוספות בסיבוב.
5. יש לשטוף את תרחיף התאים עם 500 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.01% נתרן אזיד, NaN₃.
6. הוסף את הנוגדנים לצביעת ציטוקינים תוך תאיים (בחירת הנוגדנים תיקבע על ידי החוקר). הכתימו את תרחיף התא עבור סמנים ספציפיים של תאי לימפוציטים אנושיים (למשל, CD45, CD3 וכו ') למשך שעה אחת. לשטוף את התאים עם PBS, לתקן לחדור אותם.
7. תקן את התאים באמצעות 500 μL של 1%-2% paraformaldehyde במשך 1 שעות.
8. לספור את התאים על ידי hemocytometer, permeabilize 10⁶ תאים עם 100 μL של 0.1% saponin במשך 15 דקות, לדגור את התאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים. לשטוף את התאים ולנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימה.
   הערה: כמות הנוגדנים המסומנים בפלואורסצנטית תהיה ספציפית לכל ציטוקין. בצע את הוראות היצרן. בדרך כלל, 10⁶ תאים ב 100 μL של תמיסה יהיה מוכתם במשך 1 שעות. רוב הנוגדנים המתקבלים מסחרית יספיקו כדי לבצע 25-100 בדיקות.
9. לדגור על התאים עם נוגדנים תוך-תאיים לצביעת ציטוקינים (למשל, אינטרפרון-גמא, IFN-γ וגורם נמק גידולי בטא, TNF-α או אינטרלוקין, IL-13 ו-IL-17A) למשך שעה
   הערה: מומלץ להכתים תחילה סמני פני שטח, ולאחר מכן תוך תאיים שכן קיבוע יכול לגרום לשינויים קונפורמטיביים בחלבוני פני השטח אליהם נקשרים נוגדנים.
10. שטפו את התאים עם 500 μL של PBS והשהו מחדש ב-100 μL של PBS לפני איסוף נתונים על ציטומטר זרימה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אמוניום כלורי	סיגמא אולדריץ'	213330
ברפלדין	סיגמא אולדריץ'	B6542
רשת ניילון סטרילית Filcon	בקטון דיקינסון	340606
מצע ג'לטין, Enzchek	בדיקות מולקולריות	E12055
מסובב צינור מיקס MACS	Miltenyi ביוטק	130-090-753
מדימכונה	בקטון דיקינסון		מספר קטלוגי אינו זמין
ספונין	סיגמא אולדריץ'	8047152