קביעת ייצור ROS על ידי נויטרופילים באינטראקציה עם ביופילם אופסוני

תקציר

מקור: Rana, P. S. J. B., et al. Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת כימילומינסנציה במבחנה כדי לזהות את הדור של מיני חמצן תגובתי על ידי נויטרופילים לאחר חשיפה לביופילם חיידקי opsonized.

פרוטוקול

1. מדידת ROS המיוצר על ידי נויטרופילים

1. הוסף 100 μL של 20% סרום אנושי רגיל (מדולל ב- HBSS) טיפה לביופילם השטוף ודגר ב 37 ° C בתנאים סטטיים במשך 30 דקות כדי opsonize את הביופילם.
2. שאפו את תמיסת הסרום 20% ושטפו את הביופילמים עם 150 מיקרוליטר HBSS פעם אחת. שאפו את HBSS, השאירו מאחור בארות עם ביופילמים opsonized.
   הערה: לצורך פענוח הניסוי, מומלץ לפחות ארבע קבוצות: (A) נויטרופילים + ביופילם, (B) נויטרופילים + PMA (בקרה חיובית, ראו טבלת חומרים), (C) נויטרופילים בלבד, ו-(D) ביופילם בלבד.
3. הוסף לומינול (ראה טבלת חומרים) לנויטרופילים המרחפים מחדש ב- HBSS בריכוז של 4 x 10⁶ תאים/מ"ל כך שריכוז הלומינול הסופי הוא 50 מיקרומטר. פתרון זה מוכן לשימוש עבור קבוצות (A) ו- (C). הוסף 4 x 10⁵ נויטרופילים מעורבבים עם luminol לבארות עם ביופילמים opsonized.
4. בצינור נפרד, הכינו תמיסת לומינול 50 מיקרומטר ב- HBSS ללא נויטרופילים והוסיפו אותה לבאר המכילה ביופילם (קבוצה D).
5. Aliquot 350 μL של נויטרופילים מעורבבים עם luminol ולהוסיף phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) בריכוז סופי של 500 ng/mL לתערובת. עבור קבוצה (B), הוסף 4 x 10⁵ נויטרופילים מתערובת זו לתוך בארות ללא ביופילם. זה משמש כבקרה חיובית.
   הערה: ריכוז ה-PMA המצוין בשלב זה גבוה יחסית כדי להבטיח תגובת פרץ חזקה, שכן נויטרופילים המעוררים PMA הם בקרה חיובית. PMA יכול לשמש בריכוז נמוך יותר כדי להפעיל נויטרופילים, בהתאם לניסוי.
6. צנטריפוגה את הצלחת ב 270 x גרם במשך 30 s ב 4 ° C.
7. ודא שקורא הלוחות מוגדר ל- 37°C יחד עם ההגדרה לקריאה זוהרת וקינטית למשך 60 דקות עם מרווחים של 3 דקות. הניחו את הצלחת בקורא הלוחות כדי למדוד את ייצור ה-ROS על ידי נויטרופילים למשך 60 דקות.
   הערה: לצורך בדיקה זו, ביופילמים גודלו בלוחות לבנים המשמשים לבדיקות זוהר. PMA ידוע כאגוניסט לתגובת פרץ חמצונית. בעת ביצוע מחקרים הכוללים PMA, ודא כי PMA נוסף בשלב הסופי בעוד התמיסה המכילה נויטרופילים היא קרה מאז PMA מיד יוזם את תגובת פרץ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	תרמו סיינטיפיק	339652
ספוגית אלכוהול	ב.ד.		משמש לשאיבת דם
מונה תאים	Bal Supply	202ג
תחתית שקופה 96 לוחות פוליסטירן שטוחים היטב	כוכב משנה	3370
מי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco 1x	גיבקו	14190-144
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) 1x	קורנינג סלגרו	21-022-CV	ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום
המוציטומטר	קו בהיר
לומינול	סיגמא	A8511-5G
מדיה חיונית מינימלית (MEM) אלפא 1x	גיבקו	41061-029
סרום אנושי רגיל	טכנולוגיה משלימה	NHS
צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ)	VWR	25384-342
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט
תמיסת פולי-L-ליזין	סיגמא	P4707-50ML
תוכנת SoftMax Pro	התקנים מולקולריים		תוכנת קורא Microplate המשמשת לרכישת נתונים
SpectraMax i3x	התקנים מולקולריים		קורא Microplate