$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת ביופילם חוץ גופי
- השג מושבות מבודדות של S. aureus ממלאי הקפאה באמצעות טכניקת צלחת פסים על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים, כגון אגר סויה טריפטי (ראה טבלת חומרים).
- מצפים בארות בודדות של צלחת 96 בארות עם 100 μL של 0.001% (v/v) פולי-L-ליזין (PLL) מדולל בסטרילי H2O ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מבחינה אספטית יש לשאוף את תמיסת PLL באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום. הניחו לבארות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
הערה: כל שלבי השאיפה בפרוטוקול מבוצעים באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום, אלא אם צוין אחרת.
- הכינו תרבית לילה על ידי חיסון מושבה של S. aureus במדיה חיונית מינימלית אלפא (MEMα) בתוספת 2% גלוקוז ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס, ניעור ב 200 סל"ד במשך 16-18 שעות.
- לדלל את תרבית הלילה על ידי העברת 50 μL עד 5 מ"ל של MEMα טרי בתוספת 2% גלוקוז לדגור ב 37 ° C, רועד ב 200 סל"ד, עד שלב לוגריתמי אמצעי, בדרך כלל בין צפיפות אופטית 600 (OD600ננומטר) של 0.5-0.8. השתמש ב- MEMα כדי לנרמל תרבית לוגריתמית אמצעית ל- OD600ננומטר של 0.1.
- העבר 150 μL של תרבית מנורמלת לכל באר של צלחת 96 באר שטופלה PLL. יש לדגור באופן סטטי במשך 18-20 שעות בתא לח בטמפרטורה של 37°C.
הערה: ניתן לגדל את הביופילמים גם בפורמטים אחרים, כגון שקופיות μ ערוצים (ראו טבלת חומרים).
- שאפו את הסופרנאטנט להסיר את התאים הפלנקטוניים. שטפו בעדינות את הביומסה הנותרת עם 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. הוסף HBSS טיפה כדי למנוע הפרעה biofilm.
הערה: בזמן שאיפת הסופרנאטנט וה-HBSS במהלך השטיפה, השאירו מספיק נוזלים (סופרנאטנט או HBSS) בבארות המכילות ביופילם, כך שהביופילם עדיין שקוע. זה מונע את השיבוש של מבנה הביופילם כאשר HBSS מתווסף טיפה כדי לשטוף את הביופילם.
- חזור על שלב 1.6 לפחות פעמיים נוספות כדי להסיר את כל התאים הפלנקטוניים. בשלב זה, ביופילמים מוכנים לניסויים מיידיים במורד הזרם.
הערה: אם הביופילמים אינם משמשים לניסויים בנויטרופילים, HBSS יכול להיות מוחלף במי מלח חוצצי פוספט (PBS). HBSS מועדף על פני PBS מכיוון ש- HBSS מכיל רכיבים, כולל גלוקוז, המספקים תנאים אופטימליים להפעלת נויטרופילים.
2. בידוד נויטרופילים
הערה: נויטרופילים בודדו בעקבות שיטה שפורסמה בעבר עם שינויים קלים. פרוטוקול בידוד זה משלב תחילה צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, ואחריה שיקוע דקסטרן של 3%. חלק זה מכסה רק את פרוטוקול בידוד הנויטרופילים הכולל, תוך התמקדות בשינויים שבוצעו בפרוטוקול שפורסם. יתר על כן, הפרוטוקול המתואר להלן הוא אחת מהשיטות הרבות שיכולות לבודד נויטרופילים וניתן להחליף אותן לפי הצורך. שיטות אחרות לבידוד נויטרופילים כוללות שימוש במדיה להפרדת תאים או הפרדת תאי נוגדנים מגנטיים.
- יש לשאוב דם מתורם מבוגר באמצעות ניקור עצמי, בהתאם לפרוטוקול המתואר ב-IRB המוסדי. לפני שאיבת הדם, ודא כי המזרק יש מספיק הפרין ללא חומרים משמרים, כך הריכוז הסופי של הפרין הוא 20 U / mL.
- לדלל את הדם heparinized עם 3/4 נפח של 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין (ראה טבלת חומרים) ב H2O בטמפרטורת החדר.
- עבור כל 20 מ"ל של דגימת הדם המדוללת, aliquot 14 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים) בצינור חרוטי טרי 50 מ"ל. יש להניח בזהירות את דגימת הדם המדוללת על גבי מדיום שיפוע הצפיפות.
- צנטריפוגה את דגימת הדם בשכבות ב 400 x גרם במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שלצנטריפוגה יש הפסקה איטית כדי למנוע הפרעה לשכבה לאחר השלמת הצנטריפוגה.
הערה: דגימת הדם תהיה חמש שכבות המכילות תערובת של מלוחים ופלזמה, שכבת תא חד גרעיני, מדיום שיפוע צפיפות, נויטרופילים ואריתרוציטים.
- באמצעות פיפטה סרולוגית, לשאוף את כל השכבות מעל נויטרופילים וגלולת אריתרוציטים, ואחריו השעיה עדינה של הגלולה ב 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין קר ב H2O. עבור כל גלולה המופקת מדגימת דם של 20 מ"ל, יש להשהות את הגלולה בחזרה לנפח כולל של 20 מ"ל. הוסף נפח 1:1 של 3% דקסטרן (ראה טבלת חומרים). לדגור על הצינור זקוף במשך 18-20 דקות על קרח.
הערה: ודא כי 3% דקסטרן מיוצר עם 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין ב H2O.
- הסר 20 מ"ל של השכבה העליונה המכילה נויטרופילים וכמה אריתרוציטים על צינור חרוטי חדש 50 מ"ל וצנטריפוגה אותו ב 355 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. יוצקים את supernatant משאיר מאחור גלולה אדומה.
- בעדינות להשעות את הגלולה ב 10 מ"ל של קר וסטרילי H2O במשך 30 שניות כדי lyse את אריתרוציטים הנותרים. יש להוסיף מיד 10 מ"ל של תמיסת מלח קרה ללא אנדוטוקסין 0.9% לתערובת כדי להחזיר את הטוניות. צנטריפוגה את התמיסה ב 233 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
- יוצקים את הסופרנאטנט ומשהים מחדש את הגלולה המכילה 95%-97% נויטרופילים ב-HBSS קר של 1 מ"ל לכל 20 מ"ל של דגימת הדם.
- מעבירים 10 μL של הנויטרופילים המרחפים מחדש ב-90 μL של 0.4% צבע הרחקה כחול טריפאן וסופרים את התאים באמצעות המוציטומטר (ראו טבלת חומרים).
הערה: תאים שאינם בני קיימא מוכתמים בכחול מכיוון שצבע ההרחקה הכחול של טריפאן אינו חדיר בתאים בני קיימא. פרוטוקול זה מספק >99% כדאיות התא.
- הוסף HBSS נוסף כך שהריכוז הסופי של נויטרופילים הוא 4 x 106 תאים/mL.
הערה: עבור מקרים עם <99% כדאיות התא, עדיין ניתן להשיג את הריכוז הסופי של 4 x 106 תאים/מ"ל; עם זאת, הנפח הכולל של תמיסה המכילה 4 x 106 תאים / מ"ל המתקבל יקטן. ניתן להתאים את הריכוז הסופי של נויטרופילים בהתאם לצרכי הניסוי של המשתמש. הנויטרופילים הושעו מחדש בריכוז סופי של 4 x 106 תאים/מ"ל עבור כל הניסויים המתוארים להלן. כדי להסביר את השונות בין תורם לתורם, מומלץ מאוד שכל הניסויים המעורבים בנויטרופילים יבוצעו עם לפחות שלושה תורמים שונים.
3. הדמיה של אינטראקציות ביופילם-נויטרופילים
- הגדר ביופילם באמצעות שלבים 1.2-1.6. כדי להקל על דימות ביופילם, השתמש בזן פלואורסצנטי של S. aureus, כגון USA300 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי להגביר את הקלות של דימות מיקרוסקופי.
הערה: נעשה שימוש בשקופית של 6 μ ערוצים (ראה טבלת חומרים) במקום בלוח של 96 בארות כדי להדגים את מודל הביופילם במבחנה (שלב 1).
- דגרו 4 x 106 תאים/מ"ל נויטרופילים עם 100 מיקרומטר של צבע CMAC כחול (7-אמינו-4-כלורומתילקומרין) (BCD, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בנדנדה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. ודא שהדגימות מודגרות בחושך והגביל את החשיפה לאור בשלבים הנותרים.
- כדי לשטוף עודף BCD, צנטריפוגות נויטרופילים ב 270 x גרם במשך 5 דקות ולשאוף את supernatant. השהה מחדש את הנויטרופילים ב- HBSS טרי. בשלב זה, הוסף אתידיום הומודימר-1 (ראה טבלת חומרים) לנויטרופילים המוכתמים ב-BCD בריכוז סופי של 4 מיקרומטר כדי לעקוב אחר נויטרופילים ומוות חיידקים.
- הוסף 150 μL של נויטרופילים לביופילם S. aureus שגדל בשקופיות μ, כך שהיחס בין נויטרופילים לחיידקים הוא 1:30 (נויטרופילים: חיידקים). דגרו על מגלשות μ בתא לח למשך 30 דקות. מספר תאי החיידק מבוסס על ספירת התאים המתקבלת מציפוי ביופילם של 18 שעות.
- דמיינו את האינטראקציה בין נויטרופיל לביופילם באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לאורכי גל העירור והפליטה של הצבעים/חלבונים הפלואורסצנטיים.
הערה: עבור המחקר הנוכחי, BCD הוא 353/466 ננומטר, אתידיום הומודימר-1 הוא 528/617 ננומטר, ו-GFP הוא 395/509 ננומטר. הגבל את חשיפת הדגימה ללייזר או לאור כדי למנוע הלבנה של הדגימות.
- נתח את התמונות באמצעות תוכנות ניתוח תמונה מיקרוסקופיות או תוכניות כגון FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ ו- BAIT, בין רבים אחרים.
הערה: כאשר עובדים עם כתמים, חשוב לקחת בחשבון את הספציפיות של הצבעים בשימוש. כתמים מסוימים עובדים על תאים פרוקריוטים ואוקריוטים, בעוד שאחרים עובדים רק על אחד. אם נויטרופילים וביופילמים מוכתמים בנפרד באמצעות צבעים שיכולים להכתים את שני סוגי התאים, הקפידו לשטוף את שאריות הצבע לפני שילוב נויטרופילים וביופילמים כדי למנוע צביעה צולבת.