הערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של קטעי רקמת המעי הגס

תקציר

מקור: Du, Y. W. et al., השפעות ביטול חלבון איתות טעם על דלקת מעיים במודל עכבר למחלות מעי דלקתיות.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את ההערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמת המעי הגס של עכבר. בקטע רקמה מוכתמת, נוכחותם של מספר רב של תאים המגיבים למערכת החיסון ברקמה הפגועה מייצגת את חדירת תאי החיסון במהלך קוליטיס.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת עכברים ו- DSS

1. יש לשמור את עכברי הנוקאאוט (α-gustducin^-/-) ואת עכברי C57BL/6 תואמי גיל, מין וגוף (α-gustducin^+/+) C57BL/6 בכלובים נקיים.
   הערה: עכברי הנוקאאוט הוצלבו עם עכברי C57BL/6 במשך למעלה מ-20 דורות ויש להם כמעט 100% C57BL/6 רקע גנטי.
2. יש להמיס 30 גרם של אבקת נתרן דקסטרן סולפט (DSS) בליטר אחד של מים אוטוקלאביים. מערבבים עד שהתמיסה מתבהרת כדי להבטיח שריכוז העבודה הסופי הוא 3% (w/v).
   הערה: ניתן לאחסן את פתרון DSS בטמפרטורת החדר עד שבוע או בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

2. אינדוקציה והערכה של קוליטיס DSS בעכברים

1. שקול ורשום את משקל הגוף ההתחלתי של כל עכבר. הכניסו את העכברים בנפרד לכלובי פלסטיק סטנדרטיים ותייגו את הכלובים.
2. החליפו את מי השתייה הרגילים בתמיסת DSS של 3% למשך 7 ימים בסך הכל, שאליהם יש לשתי קבוצות העכברים גישה ל-ad libitum.
3. מדוד את משקל הגוף של העכבר, רשום את צריכת פתרון DSS ואסוף ובדוק את הצואה של כל עכבר מדי יום במהלך מתן DSS. שימו לב לחומרת השלשולים והדימום הרקטלי והמירו זאת למדד המחלה הנגרמת על ידי DSS.
4. במהלך הניסוי, אחוז הירידה במשקל בהשוואה למשקל ההתחלתי ומדד המחלה מחושבים כדי להעריך את הסימפטומים של קוליטיס.
   הערה: מדד המחלה מדורג על ידי שילוב תצפיות של שלשולים ודימום רקטלי ומוגדר כדלקמן: 0 (צואה רגילה, ללא דם), 1 (צואה רכה, ללא דם), 2 (צואה רכה, מעט דם), 3 (צואה רכה מאוד, דימום מתון) ו -4 (צואה מימית, דימום משמעותי). מדד המחלה מנותח מדי יום עבור כל עכבר.
5. בסוף הטיפול בן 7 הימים ב- DSS, הקריבו את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם והמשיכו בניסויים הנותרים.

3. הכנת דגימות רקמה

1. מניחים את העכבר במצב שכיבה ולנקות את העור של הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך קו אמצע באורך 3 ס"מ בבטן עם זוג מספריים קטנים כדי לחשוף את חלל הבטן.
2. השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד בזהירות את הטחול מרקמות אחרות, ולאחר מכן להסיר את הטחול ולמדוד את גודלו.
3. לזהות ולהרים את המעי הגס עם מלקחיים ולהפריד אותו מן mesentery שמסביב. משוך את המעי הגס כולו עד שהצקום ופי הטבעת גלויים.
4. בודד את המעי הגס על ידי טרנסקטציה שלו בשולי המעי הגס ובעומק האגן כדי לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי והדיסטלי, בהתאמה. לאחר מכן, מדדו ותיעדו את אורך המעי הגס המבודד. היזהר שלא לפגוע ברקמת המעי הגס במהלך הליך הניתוח.
5. שטפו את המעי הגס עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS) עם מזרק 10 מ"ל מצויד במחט gavage כדי להסיר את הצואה והדם עד שהפולט ברור לחלוטין.
6. לזיהוי היסטולוגי, חלקו את דגימות הרקמה באופן שווה לשלושה חלקים: פרוקסימלי, אמצעי ודיסטלי. לאחר מכן, תקן את הרקמה עם 4% paraformaldehyde (PFA) לילה ב 4 ° C.
7. לניתוח ביטוי ציטוקינים, יש להקפיא את המעי הגס כולו במהירות עם חנקן נוזלי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

4. הערכה היסטולוגית של חומרת קוליטיס הנגרמת על ידי DSS

1. אימונוהיסטוכימיה
   1. לאחר הקיבוע, לטבול את הרקמה בתמיסה של 30% סוכרוז ב 1x PBS לילה בצינור 15 מ"ל כדי cryoprotect על הדגימות.
   2. הטמיעו את הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והניחו אותה בטמפרטורה של -20°C עד שה-OCT יתקשה.
   3. מעבירים את בלוק ה-OCT המכיל את הרקמה להקפאה, מגדירים את חוגת העובי בהקפאה ל-12 מיקרומטר, פורסים ואוספים מקטעים קפואים בעובי 12 מיקרומטר.
   4. מחממים את חלקי הרקמה שנאספו מהקפאה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על צלחת חמה. שטפו את המקטעים ב-PBS 1x 3 פעמים, למשך 10 דקות כל אחד. לדגור את קטעי הרקמה ב 3% מי חמצן במשך 10 דקות כדי לחסל peroxidase אנדוגני. שטפו את החלקים 3 פעמים נוספות. חסום את הרקמות עם חיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 3% (BSA), 0.3% חומר ניקוי לא יוני, 2% סרום עיזים, 0.1% נתרן אזיד ב 1x PBS) בטמפרטורת החדר למשך שעה או יותר.
   5. החלף את המאגר החוסם בתמיסה המכילה את הנוגדנים הראשוניים הבאים הספציפיים לסוג תא החיסון: CD45 עבור לויקוציטים, CD3 עבור תאי T, B220 עבור תאי B, CD11b עבור מקרופאגים ו- Ly6G עבור נויטרופילים. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   6. הסר את הנוגדנים הראשוניים מחלקי הרקמה על ידי שאיפה. שטפו את המקטעים עם 1x PBS 3 פעמים, למשך 10 דקות כל אחד. יש לדגור על המקטעים עם נוגדן משני ביוטינילציה ולאחר מכן לדגור עם קומפלקס סטרפטווידין-HRP בטמפרטורת החדר.
   7. לדגור על המקטעים עם תמיסת 3,3'-diaminobenzidine (DAB) כדי לפתח צבע חום בהיר או כהה ולדמיין את התאים החיסונית.
   8. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין ו-0.3% (v/v) אמוניה מדוללת. צלם תמונות בשדה בהיר בהגדלה של פי 10 תחת מיקרוסקופ.
   9. השתמש בתוכנית עיבוד תמונה כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיית תאי החיסון המסומנים הן באפיתל והן בלמינה פרופריה (מתחת לאפיתל) על ידי הגדרת 2 מסיכות: השתמש במסיכה הראשונה בתכונה מבוססת קוביות הצבע כדי לקבוע סף זיהוי צבע ולמדוד את האזורים הצבעוניים תגובתי DAB; השתמש במסיכה השנייה כדי לקבוע את סך כל האזורים של האפיתל והלמינר בקטע שנבדק. לבטא את אוכלוסיית התאים האימונוריאקטיביים כיחס בין שטח הצביעה של התאים המוחדרים לשטח הכולל של הרקמה הנבדקת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
מגיב
דקסטרן סולפט מלח נתרן (DSS)	MP Biomedicals	2160110
קומפלקס סטרפטווידין-HRP	BD Pharmingen	551011
מלח חוצץ פוספט (PBS)	סנגון ביוטק	B548117
BD 10 מ"ל מזרק	BD Biosciences	309604
מכשירים וציוד
מאזניים
מספריים
מלקחיים
צביעת צנצנות
תוכנה
Imag-Pro Plus	מדיה Cybernetics, Inc.