הריגת תאי K562 על ידי תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם שנחשפו לתכשירי מוצרי טבק

תקציר

מקור: Arimilli, S. et al., שיטות להערכת ציטוטוקסיות ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרי טבק דליקים. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו חוקרים את ההשפעה של מדיום שלם המותנה בעשן, הכנת מוצר טבק דליק, על הרג תאי K562 על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים.

פרוטוקול

1. K562 Killing Assay

הערה: יש לגדל תאי K562 בתרבית בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ עם RPMI מלא בינוני עד שהם מגיעים למפגש של 80% לפני הבדיקה.

1. הכינו תמיסת מלאי של 5 mM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) על ידי הוספת 18 μl של DMSO לבקבוקון.
2. יש לדלל WS-CM או ניקוטין בצלחת של 96 בארות באמצעות RPMI שלם בינוני לנפח כולל של 100 μl/well כדי להשיג את יחידות הניקוטין או ריכוזי הניקוטין הרצויים עבור כל באר.
   זהירות: ניקוטין הוא רעיל מאוד ומסוכן לסביבה.
3. הוסף 100 μl של PBMCs לתוך RPMI מדיום שלם בריכוז של 1.5 x 10⁶ תאים / באר. הנפח הכולל של תאים עם WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / well.
4. מכסים את הצלחת ודגרים במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
5. שטוף את תאי K562 על ידי הוספת 10 מ"ל של DPBS וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT.
6. להשעות מחדש את התאים עם 10 מ"ל של DPBS ולספור את התאים K562.
7. הכן פתרון עבודה CFSE על ידי הוספת 1 μl של תמיסת מלאי CFSE ל- DPBS של 1 מ"ל.
8. הוסף 1 מ"ל של פתרון העבודה CFSE ל 1 מ"ל של תרחיף התאים K562 המכיל 1 - 2 x 10⁷ תאים. מערבלים ודגרים בדיוק במשך 2 דקות ב- RT.
9. מיד להוסיף 200 μl של FBS. מערבלים ודגרים בדיוק במשך 2 דקות ב- RT.
10. מוסיפים 10 מ"ל של סל"ד בינוני שלם וצנטריפוגות את הצינור ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT.
11. הסר את הסופרנאטנט של RPMI, ושבור את הכדורית, והשהה מחדש את התאים עם 10 מ"ל של RPMI מדיום שלם, וספור את תאי K562 המסומנים ב- CFSE.
12. שטפו את מרכזיות ה-PBMC על ידי צנטריפוגה של הצלחת ב-300 x גרם למשך 3 דקות ב-RT. שאפו את הסופרנאטנט על ידי פירוק הנוזל. החליפו את הכיסוי וסובבו את תחתית הצלחת. מוסיפים 200 μl של סל"ד בינוני שלם וחוזרים על שלב הכביסה פעם נוספת.
13. הוסף תאי K562 המסומנים בתווית CFSE ביחס של 1:15 (100,000 K562s:1.5 x 10 6 PBMCs) לכל באר דגימה של צלחת PBMC ודגרה נוספת במשך 5 שעות ב- 37 ° C ו- 5% CO₂.
14. שטפו את תערובת התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב RT. שאפו את הסופרנאטנט על ידי השלכת הנוזל. מניחים את הכיסוי ומערבלים את תחתית הצלחת.
15. הוסף 200 μl של חיץ ריצה וחזור על שלב הכביסה המתואר בשלב 14 פעם נוספת.
16. הוסף 95 μl של חיץ ריצה ואחריו 5 μl של 7AAD לכל באר לקבלת נפח כולל של 100 μl / well. דוגרים על הצלחת בחושך ב-RT למשך 15 דקות.
17. הוסף 100 μl של חיץ ריצה לכל באר והעבר את כל נפח תרחיף התא מכל באר של הצלחת לצינורות הצביר וקבל את הדגימות על ציטומטר הזרימה.
18. קבע את אחוז התאים החיוביים ל-7AAD וחיוביים ל-CFSE באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 X 75 צינורות	BD בז	352058
15 מ"ל צינורות חרוטיים	קורנינג	430790
2 מיקרו-צינוריות מ"ל	אקסיגן	MCT-150-C-S
50 מ"ל צינורות חרוטיים	קורנינג	430828
בקבוק 500 מ"ל	קורנינג	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
צלחת תחתונה שטוחה 96 באר	טרמו נונק	439454
96 צלחות תחתונות עגולות היטב	BD בז	353077
מכסה מנוע תרבית תאים	תרמו סיינטיפיק	1300 סדרה A2
צנטריפוגה	אפנדורף	58110R
CFSE	בדיקות מולקולריות טכנולוגיות חיים	C34554
צינורות אשכול	קורנינג	4401	מזיק בבליעה, מסרטן
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	סיגמא-אולדריץ'	D8418
DPBS	לונזה	17-512F
פ.ב.ס.	סיגמא-אולדריץ'	F2442
יחידת סינון	נלג'ין	156-4020
ציטומטר זרימה	BD Biosciences	FACS קאנטו II	8 צבעים ב- Ex 405 nm וב- Em785 nm.
ציטומטר זרימה	BD Biosciences	FACS Calibur	4 צבעים ב- Ex 495 nm וב- Em 785 nm.
תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה	כוכב העץ	פלוג'ו
ניקוטין	סיגמא-אולדריץ'	N3876	רעילות חריפה, מפגע סביבתי
פארפילם	במיס	"מ"
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6148	דליק, גירוי בעור
עט/סטרפטוקוקוס	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
מאגר ריצה	מאגר ריצה MACS, Miltenyi Biotech	130-091-221
העברת פיפטה	פישר סיינטיפיק	13-711-20
בסיס טריס	סיגמא-אולדריץ'	T1503