טכניקת מבחנה לחקר טיפולים אנטי-מיקרוביאליים על אגרגטים חיידקיים

תקציר

מקור: גנון, א. ד. ואח' כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר ההשפעה של טיפול מיקרוביאלי על אגרגטים של Pseudomonas aeruginosa (Pa). תאי Pa בעלי תווית פלואורסצנטית גדלים כאגרגטים, המחקים את דפוס הצמיחה במהלך זיהום. לאחר קריאת תיגר על האגרגטים עם ריכוז תת-קטלני של האנטיביוטיקה קוליסטין, מתבצעת הערכה בזמן אמת של האינטראקציה בין חיידקים לאנטיביוטיקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. הכנת סיסטיק פיברוזיס בינוני סינתטי (SCFM2)

הערה: הכנת SCFM2 כוללת שלושה שלבים עיקריים המתוארים להלן (איור 1).

1. עיקור של מוצין חזירי
   1. מכינים מוצין סטרילי בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל ב-SCFM2. לדוגמה, עבור נפח של 5 מ"ל של SCFM2, שקול 25 מ"ג של מוצין מסוג II בצלחת פטרי סטרילית, והכנס אותו למעקר אולטרה סגול (UV) למשך 4 שעות, בעדינות כל שעה.
   2. לאחר 4 שעות, להעביר את mucin מטופל UV לתוך צינורות autoclaved 1.7 מ"ל בתנאים סטריליים, ולאחסן ב -20 ° C.
   3. כדי לאשר עיקור מלא, יש להמיס דגימה של מוצין בנוזל סטרילי, כגון מים או מרק לוריא-ברטאני (LB), ולהתבונן תחת מיקרוסקופ.
      הערה: מוצין מעוקר ניתן לאחסן ב -20 ° C עד 6 חודשים.
2. הכנת בסיס חוצץ
   1. הכינו תמיסות מלאי מלח וחומצות אמינו על ידי הוספת הכמויות המתאימות לפי משקל למים שעברו דה-יוניזציה כמפורט בטבלה 1. סנן וחטא את כל תמיסות המלאי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, עטוף בנייר כסף כדי להגן מפני השפלת אור, ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
   2. הכן את הבסיס החוצץ על-ידי שילוב של 190 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה עם חומצות אמינו ותמיסות מלאי מלח לפי נפחים המפורטים בטבלה 1. התאם את הפתרון ל- pH 6.8, והגדל לנפח סופי של 250 מ"ל. יש לסנן ולעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 30 יום.
   3. בערב שלפני הניסוי, יש לערבב את הכמות הרצויה של בסיס חוצץ לתוך בקבוק תרבית זכוכית, ולהוסיף מוצין (5 מ"ג/מ"ל כמתואר בשלב 1.1.1) ודנ"א של זרע סלמון מטוהר (0.6 מ"ג/מ"ל). יש להתסיס בעדינות, לעטוף בנייר כסף ולהשאיר בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לאפשר למוצין ולדנ"א להתמוסס לתמיסה.
      הערה: יש להפשיר את ה- DNA של זרע סלמון על קרח, לערבל אותו ולהוסיף אותו לבסיס חוצץ ולמוצין. יש להכין תמיסות מלאי טריפטופן, אספרגין וטירוזין בתמיסות של NaOH (ראו טבלה 1 לריכוזים) במקום מים שעברו דה-יוניזציה. שמור את בסיס האגירה ואת כל פתרונות המלאי עטופים בנייר כסף כדי להגן מפני חשיפה לאור. רוב המניות יהיו יציבות עד חודש. אין להשתמש במלאי שדהוי ויש להחליפם לפני השימוש.
3. הוספת מלאי משלים
   1. ביום הניסוי, הוסף את המניות המפורטות בטבלה 2 לבסיס החוצץ המכיל מוצין ו- DNA.
      הערה: הכינו תמיסת FeSO₄ טרייה ביום הניסוי, אך ניתן להכין מראש את כל שאר המלאי ולאחסן למשך 30 יום בטמפרטורה של 4°C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) מכיל כלורופורם. יש לטפל בזהירות, ואין להשתמש בקרבת אש גלויה. לאחר הוספת DOPC, יש לדגור על SCFM2 בטמפרטורה של 37°C עם רעידות (250 סל"ד) למשך 20 דקות לפחות (לתרבית של 5 מ"ל). תקופת דגירה זו מאפשרת לכלורופורם ב-DOPC להתאדות. הבקבוק לא צריך להיות אטום; במקום זאת, כסו את פתח הבקבוק באופן רופף בנייר כסף.

2. הערכה בזמן אמת של סבילות מיקרוביאלית בצברים חיידקיים

1. הכינו תרביות לילה
   1. בערב שלפני הניסוי, חסן 5 מ"ל של מרק LB עם כמה מושבות של Pa PAO1-pMRP9-113 מצלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה (carbenicillin 300 μg / mL). גדל לילה ב 37 °C עם תסיסה ב 250 סל"ד.
      הערה: לגדל תרביות לילה בתוספת אנטיביוטיקה הדרושה לבחירת פלסמידים נדרשים (כאן, פלסמיד ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), pMRP9-1). שימו לב שיש לשטוף את תאי Pa לפני חיסון SCFM2. LB עשוי להיות מוחלף באמצעי מעבדה עשירים אחרים עבור תרביות לילה. יש לטפל בכל מבודדי החיידקים באמצעות הנחיות BSL-2 מתאימות לאורך פרוטוקול זה.
2. חיסון SCFM2
   1. ביום הניסוי, דיללו בחזרה תרביות לילה של Pa 1:10 (תרבית: מדיה נוזלית) על ידי חיסון 500 μL לתוך 5 מ"ל של מרק LB טרי. גדל תאים עד שלב יומן (60-90 דקות) ב 37 ° C עם תסיסה ב 250 סל"ד.
   2. תרביות שלב רישום צנטריפוגות ב-10,000 × גרם למשך 5 דקות. שטפו את התאים על ידי הסרת הסופרנאטנט והשעייתם מחדש ב-3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט מעוקר במסנן (PBS, pH 7.0). חזור על הפעולה פעמיים, והשהה מחדש את הגלולה בנפח סופי של 1 מ"ל של PBS.
   3. מדוד את ספיגת התאים שנשטפו באמצעות ספקטרופוטומטר ב- 600 ננומטר (OD600), וחשב את נפח התרבית הדרוש ל- OD600 התחלתי של 0.05 ב- 5 מ"ל של SCFM2. יש לחסן את Pa לתוך SCFM2 ולערבל בעדינות כדי לפזר תאים לכל אורכו. פיפטה 1 מ"ל של SCFM2 מחוסן לתוך כל תא של 4-באר, תחתית זכוכית, צלחת אופטית, ולדגור במשך 4 שעות סטטית ב 37 ° C.
      הערה: זמן ההכפלה של תרביות אבא תלוי בזן ובזמינות החמצן. ב- SCFM2, בתנאים המתוארים כאן, זמן ההכפלה של Pa הוא ~ 1.4 שעות.

3. הדמיה של אגרגטים במהלך טיפול אנטיביוטי במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ובתוכנה ללכידת תמונה להדמיית אגרגטים Pa ב-SCFM2. המטרה היא להתבונן ולאפיין את הביומסה החיידקית הנותרת (הסובלנית) לאחר הטיפול באנטיביוטיקה. ניתן לבצע את השלבים המתוארים בהצלחה על מיקרוסקופים קונפוקליים אחרים, אם כי יש להפנות את מדריך ההפעלה של המכשיר לקבלת הדרכה ספציפית.

1. תמונה תרביות Pa באמצעות תא מחומם או מיקרו-צלחת מחוממת המותקנת על במת המיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורת סביבה של 37 מעלות צלזיוס. הפעל את מודול הדגירה לפחות שעתיים לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר לכל המכשירים להגיע לטמפרטורה הרצויה, ולהפחית התרחבות ותנועה נוספות במהלך איסוף הנתונים.
2. לאחר 4 שעות, מעבירים תרביות SCFM2 המכילות תאי Pa לשלב המיקרוסקופ המחומם. ייעד 3 מתוך 4 בארות כמשכפלים טכניים לטיפול אנטיביוטי, ושקול את הבאר הרביעית כבקרה ללא טיפול, המכילה רק תאי Pa ב- SCFM2, ללא אנטיביוטיקה. זהה אגרגטים באמצעות מיקרוסקופ brightfield בכרטיסייה איתור לפני כל עירור של כתבים פלואורסצנטיים. הגדר אזור להדמיה בתוך כל באר, ואחסן את מיקומו (קואורדינטות x-y-z) באמצעות מודול המיקומים בתוכנת ההדמיה.
3. השתמש במטרה של טבילת שמן 63x כדי לדמיין תרביות Pa המכילות את ביטוי GFP פלסמיד pMRP9-1 ב- SCFM2 עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 509 ננומטר. צלמו תמונות באמצעות האפשרות z-stack במודול הרכישה במרווחים של 1 מיקרומטר (סה"כ 60 פרוסות). השתמש במודול ממוצע הקו כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע בערוץ GFP בנפח הכולל של תמונות z stack של 60 מיקרומטר (1,093.5 מ"מ3). צלם תמונות שליטה של SCFM2 לא מחוסן באמצעות הגדרות זהות כדי לקבוע את פלואורסצנטיות הרקע לניתוח תמונה.
   הערה: התמונות מתקבלות על ידי הפקת 512 פיקסלים x 512 פיקסלים (0.26 מיקרומטר x 0.26 מיקרומטר פיקסלים) תמונות בערימת z של 8 סיביות המרוחקות 60 מיקרומטר מבסיס הכיסוי.
4. השתמש באפשרות סדרת הזמן בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד 60 פרוסות בכל מיקום (היטב) במרווחים של 15 דקות על פני פרק זמן של 18 שעות. השתמש באסטרטגיית המיקוד המוגדרת בתוך התוכנה כדי לאחסן מישור מוקד עבור כל מיקום, אשר מוחזר בכל נקודת זמן במהלך הניסוי.
5. לאחר 4.5 שעות של דגירה, צלם כל מיקום באמצעות ההגדרות לעיל כדי לקבוע את הביומסה המצרפית בתוך כל אחת מארבע הבארות לפני הוספת אנטיביוטיקה.
6. לאחר 6 שעות של דגירה כוללת, יש להוסיף אנטיביוטיקה בריכוז מעכב מינימלי (MIC) נמוך פי 2 לכל שכפול. פיפטה ישירות ובעדינות למרכז הבאר, ממש מתחת לשלב האוויר-נוזל. שמור על כל התרבויות בתא קונפוקלי מחומם.
   הערה: כאן נעשה שימוש בקוליסטין סולפט בריכוז של 140 מק"ג/מ"ל.
7. התחל טיפול הדמיה לאחר אנטיביוטיקה על ידי לחיצה על האפשרות התחל ניסוי בתוך תוכנית ההדמיה.
   הערה: ריכוז האנטיביוטיקה בשימוש תלוי באנטיביוטיקה, ב-Pa isolate, ובשאלה אם המשתמש מעוניין לבחון השפעות הרג או סבילות. ניסוי זה משתמש במנה אחת. ניתן להוסיף מנות נוספות מבלי להפריע לתרביות במידת הצורך.

4. צביעת יודיד פרופידיום של אגרגטים Pa

הערה: פרופידיום יודיד (PI) משמש בדרך כלל כמגיב מכתים לזיהוי תאי חיידקים שאינם בני קיימא (מתים) בתרבית. כאן, הוא משמש לזיהוי אגרגטים רגישים לטיפול אנטיביוטי המיושם בסעיף 3. לאורך פרוטוקול זה, הביטוי והזיהוי של GFP בתאי Pa משמש כפרוקסי העיקרי לכדאיות התא. שלב אחרון זה מאפשר להשתמש שוב בהדמיה קונפוקלית כדי לזהות את המיקום המרחבי של אגרגטים חיים/מתים ביחס זה לזה. בנוסף, צברים מזוהים כחיים/מתים לצורך מיון תאים במורד הזרם בסעיף 3.

1. לאחר 18 שעות, הוסיפו PI לכל באר של צלחת תחתית אופטית בעלת ארבעה תאים המכילה תרביות SCFM2. עקוב אחר הוראות היצרן עבור נפח PI וזמן הדגירה (למשל, ~ 2 μL לכל מ"ל של תרבית, ~ 20-30 דקות).

5. בידוד תאים חיים מצברים באמצעות גישת מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)

הערה: FACS מציג פלטפורמה רבת עוצמה למיון ובידוד קבוצות תאים על פי פנוטיפ מתויג פלואורסצנטית. כאן, FACS משמש לבידוד אגרגטים חיים (עמידים לאנטיביוטיקה) מאגרגטים שאינם בני קיימא.

1. לאחר צביעה עם יודיד פרופידיום, להסיר את התרביות מן הדגירה, ולהעביר מכשיר FACS במיכל מבודד כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס.
2. הפעל 1 מ"ל aliquots של SCFM2 המכילים אגרגטים Pa בקצב הזרימה הנמוך ביותר.
   הערה: כל aliquot יכיל ~15,000 אגרגטים.
3. כדי לזהות GFP, האר את התאים בלייזר של 488 ננומטר, והקלט את גובה האות הפלואורסצנטי ב- 530/30 ננומטר. דמיינו את צביעת PI על ידי עירור עם לייזר 561 ננומטר, והקלטו את גובה האות הפלואורסצנטי ב- 610/20 ננומטר. בצע מיון באמצעות זרבובית 70-u.
   הערה: ניתן לאגד צברים ממוינים במספר דרכים, בהתאם ליישום המשתמש. במקרה זה, FACS שימש למיון צברי Pa קיימא עבור ריצוף RNA במורד הזרם.

טבלה 1: הכנת מלאי מלח, חומצות אמינו, דנ"א ומוצין הדרושים לבסיס חוצץ של תווך כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי, SCFM2.

כימי	ריכוז מלאי (M)	ריכוז סופי (mM)	הערות
נה"ה 2ת.ד. 4	0.2	1.3
נא2HPO4	0.2	1.25
KNO3	1	0.35
יא2SO4	0.25	0.27
NH4Cl		2.28	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
KCl		14.94	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
NaCl		51.85	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
MOPS		10	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
Ser	0.1	1.45
גלו-הידרוכלוריד	0.1	1.55
מקצוען	0.1	1.66
גלי	0.1	1.2
עלא	0.1	1.78
ואל	0.1	1.12
פגשתי	0.1	0.63
איל	0.1	1.12
לאו	0.1	1.61
אורן HCl	0.1	0.68
ליס הידרוכלוריד	0.1	2.13
ארג הידרוכלוריד	0.1	0.31
טרפ	0.1	0.01	הוכן ב 0.2 מ 'NaOH
אספ	0.1	0.83	הוכן ב 0.5 מ 'NaOH
צור	0.1	0.8	הוכן ב 1.0 מ 'NaOH
Thr	0.1	1.07
Cys HCl	0.1	0.16
Phe	0.1	0.53
HCl שלו H2O	0.1	0.52
DNA של זרע סלמון		0.6 מ"ג/מ"ל
מוצין חזירי		5 מ"ג/nL

טבלה 2: הכנת מלאי נוסף הדרוש לבסיס חוצץ של תווך כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי, SCFM2.

כימי	ריכוז מלאי (M)	ריכוז סופי (mM)	הערות
דקסטרוז (D-glu2cose)	1	3
L-חומצה לקטית	1	9.3	כוונן ל-pH 7.0 עם NaOH
CaCl2 * H2O	1	1.75
MgCl2*6H2O	1	0.61
FeSO4*7H2O	1 מ"ג/מ"ל	0.0036	להכין טרי מדי יום
N-אצטילגלוקוזאמין	0.25	0.3
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline (DOPC)	25 מ"ג/מ"ל	100 מיקרוגרם/מ"ל	יש לדגור במשך 20 דקות לפחות בטמפרטורה של 37°C לאחר ההוספה

תוצאות

איור 1: הכנה וחיסון של מדיום SCFM2. (A) בסיס חוצץ מוכן באמצעות מלחים וחומצות אמינו המפורטים בטבלה 1 ובטבלה 2. בסיס חוצץ ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 30 ימים, אבל חייב להיות מוגן מפני חשיפה לאור. (B) מוצין ודנ"א מתווספים לאליקוט של בסיס חוצץ ומומסים לתמיסה למשך הלילה ב-4°C. (C) שומנים ומלאי נוסף מתווספים לתמיסת הלילה ומודגרים ב-37°C עם תסיסה ב-250 סל"ד למשך 20 דקות. SFCM2 מחוסן לאחר מכן בתאי פאזת יומן שטופים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצות אמינו
אלנין	Acrs אורגני	56-41-7
ארגינין הידרוכלוריד	מגה	1119-34-2
אספרגין	Acrs אורגני	56-84-8	הוכן ב 0.5 מ 'NaOH
ציסטין הידרוכלוריד	אלפא עזר	L06328
חומצה גלוטמית הידרוכלוריד	Acrs אורגני	138-15-8
גליצין	Acrs אורגני	56-40-6
היסטידין הידרוכלוריד H2O	אלפא עזר	A17627
איזולאוצין	Acrs אורגני	73-32-5
לאוצין	אלפא עזר	A12311
ליזין הידרוכלוריד	אלפא עזר	J62099
מתיונין	Acrs אורגני	63-68-3
אורניתין הידרוכלוריד	אלפא עזר	A12111
פנילאלנין	Acrs אורגני	63-91-2
פרולין	אלפא עזר	A10199
סרין	אלפא עזר	A11179
תראונין	Acrs אורגני	72-19-5
טריפטופן	Acrs אורגני	73-22-3	הוכן ב 0.2 מ 'NaOH
טירוזין	אלפא עזר	A11141	הוכן ב 1.0 מ 'NaOH
ולין	Acrs אורגני	72-18-4
אנטיביוטי
קרבניצילין	אלפא עזר	J6194903
יום המניות
CaCl2* 6H2O	פישר כימיקלים	C79-500
דקסטרוז (D-גלוקוז)	פישר כימיקלים	50-99-7
1,2-דיולאואיל-SN-גליצרו-3-פוספוכולין (DOPC)	פישר (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	יש לנער 15-20 דקות ב-37°C כדי לאדות כלורופורם
FeSO4 * 7H2O	Acrs אורגני	7782-63-0	ציר זה שווה 1 מ"ג / מ"ל, חייב לעשות טרי
L-חומצה לקטית	אלפא עזר	L13242	מניית pH ל-7 עם NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acrs אורגני	7791-18-6
N-אצטילגלוקוזאמין	TCI	A0092
מוצקים מוכנים
מוצין חזירי	סיגמא	M1778-100G	עיקור UV
DNA של זרע סלמון	Invitrogen	15632-011
כתם
פרופידיום יודיד	אלפא עזר	J66764MC
מלחי
יא2SO4	אלפא עזר	A13975
KCl	אלפא עזר	J64189	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
KNO3	Acrs אורגני	7757-79-1
MOPS	אלפא עזר	A12914	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
NaCl	פישר כימיקלים	S271-500	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
נא2HPO4	RPI	S23100-500.0
נה"ה 2ת.ד. 4	RPI	S23120-500.0
NH4Cl	Acrs אורגני	12125-02-9	הוסף מוצק ישירות לבסיס האגירה
חומרים מתכלים
צינורות חרוטיים (15 מ"ל)	פלסטיק אולימפוס	28-101
צינורות חרוטיים (50 מ"ל)	פלסטיק אולימפוס	28-106
צינורות תרבית עם מכסה זרימת אוויר	פלסטיק אולימפוס	21-129
צלחת בעלת תחתית זכוכית בעלת ארבעה תאים בקוטר 35 מ"מ	סלוויס	NC0600518
מרק לוריא-ברטאני (LB)	ג'נסי סיינטיפיק	11-118
מלח חוצץ פוספט (PBS)	פישר ביוריאגנטים	BP2944100
טיפים לפיפט (עמ' 200)	פלסטיק אולימפוס	23-150RL
טיפים לפיפט (עמ' 1000)	פלסטיק אולימפוס	23-165RL
פיפטים סרולוגיים (5 מ"ל)	פלסטיק אולימפוס	12-102
פיפטים סרולוגיים (25 מ"ל)	פלסטיק אולימפוס	12-106
פיפטים סרולוגיים (50 מ"ל)	פלסטיק אולימפוס	12-107
מים אולטרה-טהורים (ללא RNAse/DNAse); מים ננו-טהורים	ג'נסי סיינטיפיק	18-194	מים ננו-טהורים המשמשים להכנת תמיסות בטבלה 1
מזרקים (10 מ"ל)	ב.ד.	794412
מזרקים (50 מ"ל)	ב.ד.	309653
מסנן מזרק PES 0.22 מ"מ	פלסטיק אולימפוס	25-244
PS cuvette semi-mico	פלסטיק אולימפוס	91-408
תוכנה
Biorender			להכנת האיורים
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson , סן חוזה, CA
אימריס	ביטפליין		גרסה 9.6
זן שחור
ציוד
FacsAriallu	Becton Dickinson , סן חוזה, CA
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי LSM 880	זיס