$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תאים לזיהום
- להפיץ קו תאים דמוי מקרופאג עכבר RAW 264.7 במדיה תרבית רקמת DMEM בתוספת 10% סרום עגל עובר (להלן DMEM/FCS) באמצעות בקבוק 125 מ"ל ואינקובטור תרבית רקמה נשמר ב 37 ° C / 5% CO2.
- יום לפני ההדבקה, השתמש במגרד תאים כדי להסיר תאים מבקבוק ההתפשטות ולאסוף בצינור חרוטי מכסה בורג 15 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 10 דקות, דקנט supernatant, להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של DMEM / FCS (ללא אנטיביוטיקה) ולקבוע את titer באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
- התאם את הטיטר ל 2 x 106 תאים / מ"ל והוסף 0.10 מ"ל (2 x 105 תאים) לבארות של צלחת תרבית רקמה של 48 בארות. ודא כי מתלה התא מכסה את כל פני השטח של הבאר.
- תאי לוחות בבארות נוספות למקור מאוחר יותר של מדיה מותנית. כמו כן, מקם 0.10 מ"ל של DMEM/FCS בשלוש בארות נוספות כדי לשמש כ'בקרת תאים'.
- יש לדגור לילה באינקובטור של תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C/5% CO2. למחרת, אין להסיר מהאינקובטור עד שהחיידק אינוקולום מוכן ומוכן לשימוש.
2. הכנת ליסטריה מונוציטוגנים (Lm) לזיהום
- יש לחסן 2 מ"ל עירוי מוח-לב (BHI) במושבה אחת מצלחת אגר טרייה (<2 ימים) של Lm ולדגור לילה ב-37°C עם ניעור ב-130 סיבובים לדקה.
- למחרת, הוסיפו 0.10 מ"ל של תרבית לילה ל-2 מ"ל BHI שחומם מראש והמשיכו לדגור ב-37°C עם רעידות עד שהצפיפות האופטית (OD600) היא בין 0.4 ל-0.6.
- קבע טיטר חיידקי משוער באמצעות נוסחת המרה נגזרת אמפירית. במעבדה שלנו, תרבית Lm הגדלה באופן אקספוננציאלי ב- BHI היא בערך 1.3 x 109 יחידות יוצרות מושבה (CFU) / OD600. צמצמו את משך הזמן שבו תרביות חיידקים נחשפות לטמפרטורת החדר.
- ממש לפני ההדבקה, התאימו את הטיטר ל-5 x 107 CFU/mL באמצעות DMEM/FCS שחומם מראש כמדלל.
3. זיהום
- עבודה מהירה ומדויקת, להוסיף 20 μL (1 x 106 CFU; ריבוי של זיהום, MOI = 5) של Lm inoculum מוכן טרי (שלב 2.4 לעיל) לבארות על ידי הטיה קלה של צלחת בזהירות הנחת קצה פיפט במדיה מעל;
הערה: הימנעו מלגעת בדפנות הבאר עם קצה הפיפט.
- מזלפים בעדינות את התוכן של כל באר כדי להבטיח ערבוב מלא; לא לנער או להטות את הצלחת באופן משמעותי כמו זה יתפשט Lm על קירות הבאר. החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור CO2 של 37°C/5%.
- הכינו תמיסת גנטמיצין של 10 מיקרוגרם/מ"ל תוך שימוש במדיה מותנית מבארות לא נגועות כמדלל.
- ב 30 דקות לאחר ההדבקה (mpi), בזהירות להוסיף 30 μL של תמיסת gentamicin (ריכוז סופי 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) בעדינות מזלפים את התוכן של הבאר כמו לפני ולהחזיר את צלחת תרבית התא ל 37 ° C / 5% CO2 אינקובטור.
- ב- 60 mpi, קצור בארות מתאימות לבדיקת CFU (נקודת זמן של 60 mpi) או לניתוח FCM (כמתואר להלן בסעיפים 4 ו- 5, בהתאמה).
- עבור הבארות הנותרות, בזמנים שונים לאחר מכן או לקצור תאים כמו קודם או, עבור בדיקת הופעת Lm, להסיר לחלוטין מדיה מן הבאר ולהחליף אותו עם 150 μL של מדיה מותנית ללא גנטמיצין.
4. עיבוד דגימה וניתוח של Lm תוך תאי ומתפתח על ידי בדיקת CFU
- כדי לקצור, להטות מעט את המנה בזהירות להסיר את כל התקשורת מן הבאר. מוסיפים לבאר 0.50 מ"ל מים סטריליים מזוקקים (dsH2O). לאחר 30 שניות, להעביר את ליזט המים שנוצר (100) לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל מערבולת במרץ במשך 10 שניות.
- הכינו דילולים של 10-1 ו-10-2 על ידי הוספת 4.5 μL או 50 μL של ליזט המים ל-450 μL של dsH2O וערבול קצר כדי להבטיח ערבוב יסודי.
- יש לפזר 50 μL מתוך 100, 10-1 ו/או 10-2 דגימות על צלחות אגר של מרק ליזוגני (LB).
- כדי לבדוק עבור Lm מתפתח (שלב 3.6 לעיל), להסיר 10 μL של מדיה כיסוי ולחלק אותו לשני aliquots 5 μL: כדי aliquot אחד להוסיף 5 μL של DMEM/FCS ול aliquot השני להוסיף 5 μL של DMEM/FCS המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin. הבקרה האחרונה מבחינה בין Lm חוץ-תאי (רגיש לגנטמיצין) לבין Lm תוך-תאי (עמיד לגנטמיצין) בבדיקת CFU שלאחר מכן.
- לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים 90 μL של dsH2O, מערבלים במרץ במשך 10 שניות, ומפזרים 50 μL על לוחות אגר LB.
- מנה מושבות Lm על לוחות אגר LB לאחר יומיים של דגירה ב 37 ° C.