ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה

תקציר

מקור: Gayle, P. et al., שימוש בפתוגן חיידקי כדי לבדוק תגובות מארח ברמה התאית והאורגניזמית. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מכמתים מונוציטוגנים ליסטריה מונוציטוגנים תוך-תאיים וחוץ-תאיים, חיידק פתוגני תוך-תאי, בעקבות הדבקתם במקרופאגים בתרבית במבחנה באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

1. עיבוד דגימה ואנליזה של Lm תוך-תאי ומתפתח על ידי ציטומטריית זרימה (FCM)

1. הכינו קו תאים דמוי מקרופאג עכבר RAW 264.7 בתרבית רקמת DMEM בתוספת 10% נסיוב עגל עובר (להלן DMEM/FCS) באמצעות בקבוק 125 מ"ל ואינקובטור תרבית רקמה הנשמר ב 37 ° C / 5% CO₂. התאם תאים ל- 1 x 10⁶ תאים/מ"ל והוסף 1 מ"ל (1 x 10⁶ תאים) לבארות של צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות.
2. הכן ליסטריה מונוציטוגנים, Lm, חיידק inoculum ולהדביק תאים עם נפח של inoculum המתאים MOI של 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. 1.5 שעות לאחר ההדבקה (hpi), לאסוף מדיה מן הקבוצה הראשונה של בארות ומניחים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ומניחים על קרח עד שכל הבארות עובדו.
4. כדי לאסוף Lm תאי, להוסיף 1 מ"ל של ds H₂O לבאר ולאחר 60 שניות, להעביר את המים lysate וכתוצאה מכך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם 500 μL של 4% PFA. מערבלים במרץ במשך 10 שניות ומניחים על קרח עד שכל הבארות עובדו.
5. עבור הבארות הנותרות, הסר מדיה והחלף ב- 1 מ"ל DMEM/FCS ב- 5 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין כדי להרוג Lm חוץ-תאי ולהחזיר מיד תאים לאינקובטור.
6. לאחר 30 דקות (2 hpi) הסר מדיה והחלף ב- DMEM/FCS ללא גנטמיצין.
7. לאחר 2 ו 4 שעות (4 ו 6 hpi) לקחת נקודות זמן השני והשלישי על ידי איסוף מדיה lysates.
8. צינורות צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 7 דקות. להסיר supernatant מבלי להפריע את הכדור.
9. יש להשהות כל גלולה בקוקטייל מכתים של 50 μL של 4% PFA ו-15 μL של פאלואדין. לדגור צינורות בחושך ב 4 ° C במשך 20 דקות.
10. לאחר הדגירה יש להוסיף 1 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
11. סובבו את הצינורות במהירות של 10,000 x גרם למשך 7 דקות. הסירו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור.
12. יש להשהות כל גלולה במאגר FACS של 400 μL לשימוש מיידי, או 200 μL של מאגר FACS ו-200 μL של 4% PFA אם מאחסנים אותו לניתוח מאוחר יותר.
13. הפעל דגימות על ציטומטריית זרימה ונתח את הנתונים שנאספו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציר BHI (עירוי לב המוח)	EMD מיליפור	110493
מסננת תאים, 70 מיקרומטר	VWR	10199-656
קולגנאז D	רוש	11088858001
מדיית DMEM	גיבקו	11965-092
צינורות FACS	BD בז	352054
FBS - מנוטרל חום	סיגמא-אולדריץ'	F4135-500ML
תמיסת המלח המאוזנת של הנקס	סיגמא-אולדריץ'	H6648-6X500ML
ל.ב. אגר	לגדל תאים MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD ערכת כתמים של תאים מתים צהובים הניתנים לתיקון	לייף טכנולוגיות	L349S9
רודאמין פלואידין	תרמו פישר	₪105
SP6800 מנתח ספקטרלי	סוני
תרבית רקמות TPP צלחות 48 באר	MIDSCI	TP92048
תרבית רקמות TPP צלחות 6 בארות	MIDSCI	TP92406