1. אספו והכינו זבובים
- Drosophila melanogaster אחורי בתנאי הניסוי הרצויים. יש להקפיד לא להעמיס על הזבובים במהלך הגידול ולוודא כי צפיפות הזחלים עקבית בכל הטיפולים, שכן תנאי הסביבה בשלב הזחל יכולים להשפיע עמוקות על פנוטיפים של הגנה חיסונית בשלב הבוגר.
- לאסוף זבובי ניסוי 0 - 3 ימים לאחר eclosion מן מקרה גולם ולהעביר אותם על מדיום טרי.
- בית את הזבובים שנאספו בטמפרטורה הרצויה (טמפרטורות בין 22 °C (75 °F) ו 28 °C (75 °F) מתאימים בדרך כלל) עד שהם בגיל 5 - 7 ימים לאחר eclosion.
הערה: זה מאפשר מספיק זמן לזבובים להשלים מטמורפוזה ולהפוך לבוגרים, אבל זה הרבה לפני תחילת ההזדקנות.
- מיין את מספר הזבובים הרצוי לבקבוקון נפרד לפני ההדבקה, שוב תוך הקפדה על מניעת צפיפות.
הערה: רק זכרים נדבקים בהדגמה זו, אך באותה מידה ניתן להדביק נקבות באמצעות ההליך המתואר.
2. תרבית והכנת חיידקים
- הכינו צלחת אב של החיידקים שנבחרו לפחות יומיים לפני ההדבקה. פזרו את החיידקים ממלאי גליצרול של 15% המאוחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -80°C. אחסנו את הצלחת הראשית בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. פזרו תמיד את צלחות האב ישירות ממלאי הגליצרול הקפוא. הימנעו ממעבר סדרתי של חיידקים מצלחת לצלחת, שכן מעבר חוזר ונשנה בתרבית עלול לגרום לחיידקים לפתח אלימות מוחלשת.
הערה: דוגמה זו עושה שימוש ב- Providencia rettgeri וב- Escherichia coli.
- השתמש בהליך הבא כדי להכין תרחיף חיידקי להזרקה.
- לגדל תרבית של 2 מ"ל חיידקים על ידי חיסון מדיום סטרילי עם מושבה אחת מבודדת מהצלחת הראשית. לגדל את החיידקים לשלב נייח (למשל O/N צמיחה ב 37 ° C).
הערה: גם P. rettgeri וגם E. coli גדלים היטב במרק לוריא בטמפרטורות של 20 - 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.
- לאחר שהתרבית הגיעה לשלב הנייח, פלטו בעדינות תאי גלולה מכ-600 מיקרוליטר של התרבית בצנטריפוגה שולחנית (3 דקות ב-5,000 x גרם), השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את החיידקים בכ-1,000 מיקרוליטר של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS; 137 מילימטר נתרן כלורי, NaCl, 2.7 מילימטר אשלגן כלורי, KCl, 10 mM נתרן פוספט, Na2PO4, 1.8 mM אשלגן דימימן פוספט, KH2PO4, pH = 7.4).
- לדלל את התאים המרחפים מחדש ב- PBS סטרילי כדי להשיג צפיפות אופטית (OD) המתאימה לחיידק הנמצא בשימוש, הנמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר כספיגה ב- 600 ננומטר. השתמש בתרחיף זה כדי להדביק את הזבובים.
הערה: A600 = 0.1 או 1.0 מתאים בהתאמה כ 10,8 ו 10,9 Providencia rettgeri או E. coli לכל מ"ל. מאחר שגם חיידקים חיים וגם חיידקים מתים תורמים לצפיפות אופטית, חשוב לקצור תרביות בשלב נייח לפני שגופות חיידקים מצטברות ומעוותות את הקשר בין צפיפות אופטית למספר החיידקים החיים שהוכנסו במהלך ההדבקה.
3. להדביק את הזבובים
הערה: מכיוון שחסינות דרוזופילה מושפעת מהשעון הביולוגי, חשוב לבצע זיהומים בשעה דומה של היום על פני שכפולים ניסיוניים.
- שימוש בננו-מזרק
- הכינו את מחטי הזכוכית לזיהום.
- הכינו מחט זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרופיפטה.
- באמצעות מלקחיים, לשבור את קצה המחט כדי ליצור פתח בקוטר של כ 50 מיקרומטר כדי לאפשר פליטה של נוזל.
- להרכיב את המזרק.
- הניחו את טבעת ה-O האיטום ולאחר מכן את הספייסר הלבן (גומה גדולה הפונה כלפי חוץ) על בוכנה מתכתית.
- ממלאים את מחט הזכוכית בשמן מינרלי באמצעות מזרק עם מחט 30 גרם.
- הכניסו את מחט הזכוכית המלאה דרך הקולט ולאחר מכן הניחו את טבעת ה-O הגדולה יותר סביב בסיסה, כ-1 מ"מ מהקצה הקהה של המחט.
- החליקו את המחט על בוכננת המתכת והבריגו בעדינות את הקולט עד לאבטחה.
- הוציאו את רוב השמן המינרלי מהמזרק, אך ודאו שעדיין יש נפח קטן של שמן במחט שישמש כמחסום בין המזרק לתרחיף החיידקי. ודאו שאין בועות אוויר בתוך התרחיף של השמן המינרלי או החיידקים, או בין שני הנוזלים.
- הגדר את המזרק לנפח הרצוי להזרקה (בין 9 nl ל 50 nl).
- צור פקדי פציעה.
- מלא את מחט המזרק ב- PBS סטרילי על ידי החדרת קצה המחט הנימי בזהירות לצינור של המדיה ולחיצה על כפתור "מילוי" במזרק.
הערה: מצע גידול חיידקים סטרילי יכול לשמש גם כבקרת פציעות אם הניסוי דורש הזרקה של חיידקים המרחפים במדיום הגידול שלהם. עם זאת, מכיוון שמצע גידול חיידקים מכיל רכיבים שעשויים לעורר את מערכת החיסון או בעלי השפעות אחרות על המאכסן, נשא אינרטי כגון PBS עדיף.
- מרדימים את מספר הזבובים הרצוי תחת זרימת אור של פחמן דו חמצני (CO2).
- להזריק את הזבובים בבטן הקדמית על פני השטח הגחון עם PBS סטרילי.
הערה: ניתן גם להזריק זבובים באתרים אחרים, כגון הצלחת הסטרנופלאורלית של בית החזה, אך חשוב לשמור על אתר הזרקה עקבי בכל ניסוי.
- הכניסו את הזבובים המוזרקים לבקבוקונים טריים עם תווך חדש, והניחו את הבקבוקונים על צידם עד שכל הזבובים התאוששו מההרדמה כדי למנוע מהזבובים להידבק למזון.
הערה: מומלץ להזריק את זבובי הבקרה של PBS לפני הזרקת חיידקים לזבובי ניסוי, כך שניתן יהיה להשתמש באותה מחט בשני הטיפולים. לא תמיד ניתן יהיה להשתמש באותה מחט במשך ניסוי שלם. במקרה כזה, ייתכן שיהיה רצוי לרשום באיזו מחט נעשה שימוש עם אילו זבובים ולכלול את זהות המחט כגורם ניסיוני בניתוח סטטיסטי.
- להזריק את הפתוגן החיידקי.
- מוציאים את המדיה הסטרילית שנותרה מהמזרק וממלאים מחדש את אותה מחט בתרחיף החיידקי.
- חזור על ההליך הנ"ל (3.1.3), כעת הזרקת הזבובים עם התרחיף החיידקי שהוכן בהליך 2.2.
