טכניקת דקירה ספטית להחדרת זיהום חיידקי מערכתי בזבובים

תקציר

מקור: Khalil, S., et al. זיהום חיידקי מערכתי ופנוטיפים להגנה חיסונית בדרוזופילה מלנוגסטר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה להדביק דרוזופילה על ידי החדרת חיידק פתוגני ישירות לחלל גופם. שיטה זו עוקפת מחסומי אפיתל ומנגנוני הגנה פסיביים אחרים, ומאפשרת השראת זיהום מערכתי. עם ההדבקה, התגובה החיסונית המתקבלת מוערכת על ידי ניטור תמותת זבובים וביצוע בדיקות במורד הזרם.

פרוטוקול

1. אספו והכינו זבובים

1. אחורי D. melanogaster בתנאי הניסוי הרצויים. יש להקפיד לא להעמיס על הזבובים במהלך הגידול ולוודא כי צפיפות הזחלים עקבית בכל הטיפולים, שכן תנאי הסביבה בשלב הזחל יכולים להשפיע עמוקות על פנוטיפים של הגנה חיסונית בשלב הבוגר.
2. לאסוף זבובי ניסוי 0 - 3 ימים לאחר eclosion מן מקרה גולם ולהעביר אותם על מדיום טרי.
3. בית את הזבובים שנאספו בטמפרטורה הרצויה (טמפרטורות בין 22 °C (75 °F) ו 28 °C (75 °F) מתאימים בדרך כלל) עד שהם בגיל 5 - 7 ימים לאחר eclosion.
   הערה: זה מאפשר מספיק זמן לזבובים להשלים מטמורפוזה ולהפוך לבוגרים, אבל זה הרבה לפני תחילת ההזדקנות.
4. מיין את מספר הזבובים הרצוי לבקבוקון נפרד לפני ההדבקה, שוב תוך הקפדה על מניעת צפיפות.
   הערה: רק זכרים נדבקים בהדגמה זו, אך באותה מידה ניתן להדביק נקבות באמצעות ההליך המתואר.

2. תרבית והכנת חיידקים

1. הכינו צלחת אב של החיידקים שנבחרו לפחות יומיים לפני ההדבקה. פזרו את החיידקים ממלאי גליצרול של 15% המאוחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -80°C. אחסנו את הצלחת הראשית בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. פזרו תמיד את צלחות האב ישירות ממלאי הגליצרול הקפוא. הימנעו ממעבר סדרתי של חיידקים מצלחת לצלחת, שכן מעבר חוזר ונשנה בתרבית עלול לגרום לחיידקים לפתח אלימות מוחלשת.
   הערה: דוגמה זו עושה שימוש ב- Providencia rettgeri וב- Escherichia coli.
2. השתמש בהליך הבא כדי להכין תרחיף חיידקי להזרקה.
   1. לגדל תרבית של 2 מ"ל חיידקים על ידי חיסון מדיום סטרילי עם מושבה אחת מבודדת מהצלחת הראשית. לגדל את החיידקים לשלב נייח (למשל O/N צמיחה ב 37 ° C).
      הערה: גם P. rettgeri וגם E. coli גדלים היטב במרק לוריא בטמפרטורות של 20 - 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.
   2. לאחר שהתרבית הגיעה לשלב הנייח, פלטו בעדינות תאי גלולה מכ-600 מיקרוליטר של התרבית בצנטריפוגה שולחנית (3 דקות ב-5,000 x גרם), השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את החיידקים בכ-1,000 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט סטרילי (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂PO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH = 7.4).
   3. לדלל את התאים המרחפים מחדש ב- PBS סטרילי כדי להשיג צפיפות אופטית (OD) המתאימה לחיידק הנמצא בשימוש, הנמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר כספיגה ב- 600 ננומטר. השתמש בהשעיה זו כדי להדביק את הזבובים.
      הערה: A600 = 0.1 או 1.0 מתאים בהתאמה כ 10,⁸ ו 10,⁹ Providencia rettgeri או E. coli לכל מ"ל. מאחר שגם חיידקים חיים וגם חיידקים מתים תורמים לצפיפות אופטית, חשוב לקצור תרביות בשלב נייח לפני שגופות חיידקים מצטברות ומעוותות את הקשר בין צפיפות אופטית למספר החיידקים החיים שהוכנסו במהלך ההדבקה.

3. להדביק את הזבובים

הערה: מכיוון שחסינות דרוזופילה מושפעת מהשעון הביולוגי, חשוב לבצע זיהומים בשעה דומה של היום על פני שכפולים ניסיוניים.

1. עם דקירה ספטית
   1. מכינים את המחט לדקירה.
      1. המיסו את קצהו של קצה מיקרופיפטה 200 μl והכניסו סיכת חרק זעיר בקוטר 0.15 מ"מ לתוך הפלסטיק המותך. אפשרו לפלסטיק להתמצק כך שהסיכה מוחזקת במקומה כאשר כ-0.5 ס"מ מהסיכה נמשכים מהפלסטיק.
   2. צור פקדי פציעה.
      1. מרדימים את מספר הזבובים הרצוי תחת זרימת אור של CO₂.
      2. לדקור את הזבובים בצלחת sternopleural של בית החזה עם המחט, הימנעות אתרי החיבור של הכנפיים והרגליים. במידת הצורך, הסר בעדינות זבובים מהסיכה הזעירה באמצעות מלקחיים רכים.
         הערה: ניתן לדקור את הזבובים גם באתרים אחרים, כגון הבטן הקדמית על פני השטח הגחון, אך חשוב לשמור על אתר הזרקה עקבי בכל ניסוי. דקירה דרך הקוטיקולה של הבטן נוטה להיות קשה יותר מאשר דקירת בית החזה ולכן היא פחות נפוצה.
      3. הכניסו את הזבובים הדוקרים לבקבוקון טרי עם תווך זבוב חדש, והניחו את הבקבוקון על צידו עד שכל הזבובים התאוששו מההרדמה כדי למנוע מהזבובים להידבק למזון.
   3. הציגו את הזיהום החיידקי.
      1. מרדימים את מספר הזבובים הרצוי תחת זרימת אור של CO₂.
      2. דוקרים כל זבוב באותו מיקום שבו התקשורת שולטת, טובלים את קצה הסיכה בתרחיף החיידקי שהוכן בהליך 2.2 לפני דקירה של כל זבוב.
      3. הכניסו את הזבובים הדוקרים לבקבוקון טרי עם תווך זבוב חדש, והניחו את הבקבוקון על צידו עד שכל הזבובים התאוששו מההרדמה כדי למנוע מהזבובים להידבק למזון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אינקובטור	פאוורס סיינטיפיק, בע"מ	DROS52SD
מכחול
CO2 פלייפדים	FlyStuff	59-114
CO2	איירגז	CD FG50
תערובת גידול דרוזופילה
6 אונקיות בקבוקים תחתונים מרובעים, פוליפרופילן	ג'נסי סיינטיפיק	32-130
כדורי צמר גפן נוסטריים גדולים במיוחד	מותג פישר	22-456-882
מיקרוסקופ	תאגיד אולימפוס	SZ51
בקבוקוני דרוזופילה פוליסטירן	VWR הבינלאומי	89092-720
כדורי צמר גפן גדולים נוסטריים	מותג פישר	22-456-883
בקבוק 2 ליטר	VWR הבינלאומי	89000-370
צלחות פטרי עם מכסים שקופים, רכס מוגבה; 100 . x 15 מ"מ;	VWR הבינלאומי	25384-302
ל.ב. אגר, מילר	דיפקו	244520
לולאת חיסון	VWR הבינלאומי	80094-488
פיפטות Rainin Clasic בגדלים שונים 0.1 μl עד 2 μl, 2 μl עד 20 μl, 20 μl עד 200 μl, 100 מיקרוליטר עד 1000	ריינין	PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000
קצוות מיקרופיפטה (גדלים שונים)	VWR הבינלאומי	30128-376 53503-810 16466-008
בסיס מרק לוריא, מילר	דיפקו	241420
צינורות תרבות חד פעמיים זכוכית בורוסיליקט	VWR הבינלאומי	47729-576
S-500 Orbital Shaker	VWR הבינלאומי	14005-830
צנטריפוגה	VWR הבינלאומי	37001-300
PBS pH 7.4 10x	Invitrogen	70011044
ספקטרופוטומטר SmartSpec 3000	ביו-ראד	170-2501
קוביות חצי מיקרו-נפח	ביו-ראד	223-9955
מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11255-20
שמן מינרלי, לבן, בהיר	מקרון כימיקלים עדינים	6358-10
סיכות Minutein	כלים מדעיים משובחים	26002-10
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה; טקס כלב הים	ארה"ב סיינטיפיק בע"מ	1615-5500