מדידת עומס חיידקי E. coli ב- Drosophila melanogaster בעקבות זיהום E. coli

תקציר

מקור: Khalil, S., et al. זיהום חיידקי מערכתי ופנוטיפים להגנה חיסונית בדרוזופילה מלנוגסטר. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה למדידת עומס חיידקי E. coli לאחר הזרקת E. coli לבית החזה של Drosophila melanogaster.

פרוטוקול

1. בדיקת עומס חיידקי לאחר ההדבקה

1. מדוד עומס חיידקים.
   1. בזמן שנקבע לאחר ההזרקה, מניחים כל זבוב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה על קרח.
   2. הוסף PBS של 250 μl לכל צינור והפוך את הזבובים להומוגניים באמצעות מזיק או מקציף חרוזים.
   3. לוחים את ההומוגנט על צלחת אגר LB, באמצעות פלטה ספירלית או דילול סדרתי.
      1. כדי צלחת באמצעות דילול טורי, להעביר כל זבוב הומוגנט לשורה הראשונה של צלחת 96 באר.
      2. מלא כל באר של השורות הנותרות עם 90 μl של PBS.
      3. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לקחת 10 μl מהשורה הראשונה המכילה הומוגנט זבוב ולחלק לשורה השנייה.
      4. פיפטה למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי לערבב היטב, ולאחר מכן לקחת 10 μl ולהעביר לשורה השלישית. חזור על הליך זה באמצעות השורות הנותרות.
      5. החל מהשורה התחתונה (רוב תרחיף החיידקים המדוללים), השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי לקחת 10 μl מכל באר ולהפקיד על צלחת LB, תוך דאגה לכך שהדגימות יחולקו כנקודות בדידות שאינן נוגעות זו בזו. חזור על הפעולה עד שכל הבארות נדגמו מכל שורה, וחילקו אותן בסדר יורד של דילול על צלחת LB.
      6. השאירו את הצלחת ב-RT עד שהכתמים נספגו לחלוטין בצלחת LB.
         הערה: מומלץ לייבש את צלחת LB למשך מספר ימים ב-RT לפני השימוש כדי להבטיח שהנוזל נספג בקלות, ובכך למזער את הסיכויים למגע מקרי בין נקודות הדגימה.
   4. לדגור על הצלחות O/N, תוך הקפדה שלא לגדל את הצלחות יתר על המידה כך שהמושבות יישארו קטנות ובדידות.
      הערה: בהתאם למדיום הגידול של החיידקים ולטמפרטורת הדגירה שבה נעשה שימוש, מושבות שמקורן במיקרוביוטת המעיים האנדוגנית של הזבוב עשויות להופיע בסופו של דבר על הצלחת. עם זאת, רוב החיידקים המשמשים לזיהום פתוגני גדלים הרבה יותר מהר מאשר מיקרוביוטת המעי על אגר LB ב 37 ° C.
   5. הסר את הצלחות מהאינקובטור כאשר חיידקי הניסוי גדלו מושבות גלויות (בדרך כלל 8 - 12 שעות), אך לפני הופעת מושבות מיקרוביוטת המעי של דרוזופילה (כ- 36 שעות). עבור חיידקים ניסיוניים הגדלים לאט, השתמשו באנטיביוטיקה סלקטיבית באגר LB כדי להסיר מושבות מהמיקרוביוטה של המעי.
   6. ספור את מספר המושבות עבור כל הומוגנאט.
      1. עבור לוחות ספירליים, ספרו את המושבות הגדלות באמצעות מונה מושבות אוטומטי שיכול להעריך את עומס החיידקים למ"ל הומוגנט בהתבסס על מספר ומיקום המושבות על הצלחת.
         הערה: ספירות ספירליות הן המדויקות ביותר כאשר ריכוז החיידקים הוא בטווח של 5 x 10² עד 5 x 10⁴ חיידקים למ"ל.
      2. עבור לוחות נקודתיים, ספור ידנית את המושבות עבור כל זבוב מהדילול המכיל 30 - 300 מושבות וחשב את מספר החיידקים לכל מ"ל של הומוגנט מקורי.
2. נתח את הנתונים.
   1. אם עומס החיידקים אינו נורמלי, המר את הנתונים כדי להעריך טוב יותר התפלגות נורמלית או נתח את הנתונים באמצעות ניתוח סטטיסטי לא פרמטרי (למשל, מבחן Mann-Whitney U). השתמש בניתוח Box-Cox כדי למצוא את השינוי האופטימלי; טרנספורמציות יומן טבעיות או בסיס -10 לוג הן לרוב יעילות.
   2. אם הנתונים מופצים באופן נורמלי מספיק ויש רק שני טיפולים מנוגדים, בצע בדיקת t כדי לקבוע אם שני הטיפולים גורמים לעומס חיידקי ממוצע שונה. אם ישנם משתני ניסוי מרובים או גורמים אחרים שעשויים לנבא, השתמש בניתוח שונות (ANOVA) כדי לקבוע אילו גורמים הם מנבאים משמעותיים של עומס חיידקי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי עם מכסים שקופים, רכס מוגבה; 100 x 15 מ"מ;	VWR הבינלאומי	25384-302
ל.ב. אגר, מילר	דיפקו	244520
לולאת חיסון	VWR הבינלאומי	80094-488
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה; טקס כלב הים	ארה"ב סיינטיפיק בע"מ	1615-5500
מזיק ממונע; מערבל מעבדת טלבויז	טרומנר	103
Talboys הומוגנייזר בתפוקה גבוהה	אבחון OPS	930145
כדורי טחינה בגודל 5/32 אינץ'	אבחון OPS	GBSS 156-5000-01
וורטקס ג'יני	Scientific indurstries inc.	G560
פיפטור רב ערוצי (10uL-300uL)	סרטוריוס	730360
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater	מיקרוביולוגיה בינלאומית
מונה מושבה אוטומטי ProtoCOL / מונה צלחות / קורא צלחות	מיקרוביולוגיה בינלאומית
אינקובטור	פאוורס סיינטיפיק, בע"מ	DROS52SD