בדיקה כדי לקבוע את המינון המדבק של וירוס דרוזופילה C בתאי חרק בתרבית

תקציר

מקור: Yang, S. et al., הקמת זיהום ויראלי וניתוח אינטראקציה בין וירוס מארח למלנוגסטר דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת ההשפעה הציטופתית כדי לקבוע את המינון הנגיפי הזיהומי של תרבית הרקמה של נגיף Drosophila C על תאי Drosophila S2*. מגוון ריכוזים נגיפיים משמשים להדבקת התאים בתרבית. שיעור התאים המציגים שינויים מבניים נקבע, ונתונים אלה משמשים לחישוב מינון הזיהום בתרבית הרקמה.

פרוטוקול

1. מדידת עומס וירוס דרוזופילה C על ידי בדיקת CPE

1. בחר 5 צינורות אקראיים המכילים וירוסים כדי לקבוע את המינון הממוצע של תרביות רקמת הנגיף (TCID₅₀) על ידי בדיקת אפקט ציטופתי (CPE) (יחידה אחת של TCID₅₀ = 0.7 יחידה ליצירת פלאק [PFU]).
   הערה: CPE מתייחס לשינויים מבניים בתאים מארחים הנגרמים על ידי פלישה ויראלית. הנגיף המדביק גורם לליזה של התא המארח או כאשר התא מת ללא ליזה עקב חוסר יכולת להתרבות.
2. ביום הראשון, אספו תאי S2* מוכנים על ידי פיפטינג. ספור את מספר התא. תאי צנטריפוגה במשך 300 x גרם במשך 4 דקות ולהשליך את supernatant. לדלל את התאים לצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל עם תווך שלם עבור תאי S2*.
3. זרע 1 x 10⁵ S2 * תאים (100 μL) לכל באר לצלחת 96-באר שטוחה (~ 30% מפגש).
4. בצע דילול סדרתי פי 10 של מלאי DCV עם מדיום מלא עבור תאי S2*. מוסיפים 50 μL דילול לתוך הבאר. הוסף 50 μL של מדיום תרבית ללא וירוס לבאר המסווגת כבאר הבקרה השלילית.
   הערה: עבור כל קצב דילול נעשה שימוש ב-8 בארות. מכיוון שתשואת DCV טיפוסית היא סביב 10^{8-10 9} PFU/mL, הדילול צריך לפחות לכסות ~10^{−5-10−10.}
5. ביום הרביעי, צפו ב-CPE במיקרוסקופ בעל שדה בהיר עם מטרה של 20X או 40X. לסווג באר שבה התאים נראים מטושטשים והתווך מלא בשברים כ"באר חיובית", ובאר שבה המורפולוגיה של התא תקינה כ"באר שלילית".
6. סמן בארות CPE חיוביות או שליליות עם + או –, בהתאמה. חישוב הנגיף TCID₅₀ בשיטת ריד ומואנץ'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות	מותג	352070
צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ	סיגמא	CLS430167	תרבית תאים
אינקובטור תאים	סאניו	מיר-553
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R
צנטריפוגה	אפנדורף	5424R
חממת דרוזופילה	פרסיבל	I-41NL	גידול דרוזופילה
פ.ב.ס.	Invitrogen	12657-029	תרבית תאים
מדיום החרקים של שניידר	סיגמא	S9895	תרבית תאים
תוכנה סטטיסטית	GraphPad פריזמה 7
צלחת שטוחה 96-באר	סיגמא	CLS3922	תרבית תאים
אינקובטור תאים	סאניו	מיר-553
מיקרוסקופ	אולימפוס	CKX41