כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. קציר מח עצם
- להסיר את עצם הירך ואת השוקה מעכבר ולנקות את העצמות באמצעות מכשירים סטריליים. מניחים את העצמות המנוקות במדיום Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) + 0.2 מ"ג/מ"ל L-גלוטמין + 0.05 מ"מ 2-מרקפטואתנול + 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין סולפט + 10,000 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין + 10% סרום בקר עוברי (FBS, DMEM-10 מלא) ודגור על הצינור על קרח למשך 15 דקות.
- הסר את מפרקי הכדור הפרוקסימלי והדיסטלי באמצעות מספריים. הכנס מחט 25 גרם המחוברת מזרק 10 מ"ל מלא בינוני לתוך שקע העצמות. שטפו את מח העצם באמצעות DMEM-10 מלא. השהה מחדש את כל הגושים על ידי פיטום המדיום למעלה ולמטה בעדינות.
- צנטריפוגה את התאים במשך 10 דקות ב 300 x גרם ולספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר. בשלב זה, או להקפיא את התאים באמצעות 90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) או צלחת את התאים בצלחת פטרי 15 ס"מ כדי להתמיין מקרופאגים באמצעות L929 מותנה תווך (שלב 2.1).
2. התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם
- באמצעות אמצעי התמיינות שחומם מראש (21 מ"ל של DMEM-10 שלם ו-9 מ"ל של תווך מותנה תאי L929 כמתואר על ידי סוונסון ואחרים), הכניסו תאי מח עצם לצלחת פטרי בתרבית שאינה מטופלת בתרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ (1.2-1.5 x 107 תאים). לדגור על הצלחת ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני, או CO2 במשך 7 ימים. הוסף 30 מ"ל נוספים של מדיום בידול לצלחת ביום 3 או 4.
הערה: חשוב לא להשתמש בצלחות שטופלו בתרבית רקמה, מכיוון שיהיה קשה לנתק ולקצור מקרופאגים.
- כדי לאסוף מקרופאגים, לשטוף את הצלחת עם מלוחים חוצץ פוספט (PBS) ולהוסיף 20 מ"ל של PBS קר + 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך 10 דקות. קצור את התאים על ידי pipeting PBS + EDTA מעל התאים ושטיפת הצלחת עם 10 מ"ל של PBS. ערבבו את שתי השטיפות לשני צינורות חרוטיים, בנפח 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום + 5 mM HEPES + 0.2 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה Coulter. שמור את התאים על קרח במהלך הספירה.
- זרעו את המקרופאגים בצלחות מצופות תרבית רקמה בגודל 2 x 105 תאים/מ"ל. לניסויים במיקרוסקופיה, זרעו 1 מ"ל של תאים על כיסויים ב-24 צלחות באר. עבור מבחני שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH), זרע 100 μL של תאים בצלחת 96 בארות. עבור בדיקת LDH, זרע 9 בארות (3 בארות לא מטופלות, 3 בארות עם 100% בקרות ליזיס, ו 3 בארות עבור גירוי ניסיוני).
- צנטריפוגה את צלחת 96 בארות במשך 5 דקות ב 300 x גרם כדי לוודא את התאים מפוזרים באופן שווה על פני הבאר.
- יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C + 5% CO2 לפני תחילת תהליך הפריימינג.
3. פריימינג
- החלף את המדיום בתווך טרי (DMEM-5) המכיל 100 ננוגרם/מ"ל ליפופוליסכריד או LPS (500 מיקרוליטר עבור צלחת 24 בארות או 50 מיקרוליטר עבור צלחת 96 בארות).
הערה: ישנם מגוון שינויים מבניים ב- LPS, המשפיעים על היכולת לעורר פרימינג בתיווך TLR4. LPS מסלמונלה מינסוטה R595 (Re) זמין ממספר ספקים ומומלץ.
- לדגור על הצלחת במשך 3 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
4. הפעלה של NLRP3 Inflammasome עם Nigericin ותיוג עם FAM-YVAD-FMK
- הסר את המדיום והחלף אותו עם 290 μL של DMEM-5 המכיל 5 מיקרומטר nigericin ו 5 mM גליצין. גליצין מתווסף כדי להפחית את כמות הליזה התאית המתרחשת במהלך הפעלת קספאז-1. יש לדגור במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. השתמשו הן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 והן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 כדי להבטיח שהסימון שנצפה הוא ספציפי לקספאז-1.
- במהלך 45 הדקות האחרונות, להוסיף 10 μL של 30x FAM-YVAD-FMK, מוכן על פי הוראות היצרן.
- לאחר 60 דקות, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS קר.
- הוסיפו 250 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד לכל באר ודגרו על קרח מכוסה ברדיד אלומיניום למשך 30 דקות.
- במהלך 5 הדקות האחרונות, הוסף 4 μL של 0.2 mM כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדום רחוק כדי לסמן את הגרעינים. 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), או צבעים אחרים יכולים לשמש גם כדי לתייג DNA.
- שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS קר והרכיבו את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה 7 μL נגד דהייה. הניחו למדיום ההרכבה להתקשות למשך הלילה לפני שאיטום הכיסוי למיקרוסקופ החליק באמצעות לק.
- דמיינו את המקרופאגים במיקרוסקופ קונפוקלי. Ex/Em עבור FAM-YVAD-FMK הוא 492/520nm ו- 642/661 עבור כתם חומצת גרעין פלואורסצנטי אדום רחוק. הקפידו להגדיר את המיקרוסקופ כך שתאים לא מטופלים לא יראו שום צביעת רקע בערוץ 488. אחרת, צביעת רקע FAM-YVAD-FMK תתגלה ולא קספאז-1 פעיל בפועל.
5. הדמיה של מקרופאגים מסומנים במיקרוסקופ קונפוקלי
הערה: ניתן לצפות בתאים המוכתמים לאחר שהכיסויים הורשו להחלים במהלך הלילה ואטמו לשקופית המיקרוסקופ עם לק. כאן מתוארת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ניתן לצפות בתאים גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.
- הניחו את השקף עם תאי הבקרה הלא מטופלים על במת המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ בתאים.
- באמצעות הגדרות טבלת חיפוש במיקרוסקופ (LUT), התאם את ההיסט כך שלא תהיה צביעת FAM-YVAD-FMK חיובית בתאים שלא טופלו. תהליך זה יכול להתבצע גם באמצעות מקרופאגים חסרים קספאז-1.
הערה: יש להתאים את ההיסט לכל ערוץ המשמש בניסוי, אך הגדרת ההיסט הנכון היא קריטית ביותר עבור ערוץ FAM-YVAD-FMK ותעלות נוגדנים פלואורסצנטיים. הקיזוז של ערוץ הדנ"א פחות קריטי. לאחר הגדרת ההיסט, אל תתאים הגדרה זו לשאר הניסוי.
- העבר את השקופית לדגימה שטופלה בניגריצין. מצא שדה המכיל את שני התאים החיוביים והשליליים עבור צביעת FAM-YVAD-FMK. התאם את מישור ההדמיה של ערוץ FAM-YVAD-FMK למישור בעל העוצמה הגבוהה ביותר של צביעה חיובית. זה יהיה בדרך כלל המישור שבו מרכז המוקד הדלקתי מצולם.
- התאימו את הרווח כך שהמוקדים ייראו בתאים בעלי גרעינים מעובים. לאחר הגדרת הרווח וההסטה, השאר הגדרות אלה להמשך הפעלת ההדמיה.
הערה: דרך קלה אחת לקבוע אם תא הוא פירופטוטי היא על ידי התבוננות במורפולוגיה גרעינית. לתאים עם קספאז-1 פעיל יש גרעינים מעוגלים ומעובים, בעוד שגרעינים נראים בתאים ללא הפעלת קספאז-1 והמורפולוגיה הגרעינית דומה לזו של תאים לא מטופלים.
- אסוף תמונות של 5 שדות שנבחרו באופן אקראי בהגדלה כוללת של 100X. התוצאה תהיה בדרך כלל כ-40 תאים לכל תמונה. חזור על תהליך זה עבור כל דגימה.
- ספור את מספר התאים בכל תמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. לאחר מכן ספור את מספר התאים שיש להם צביעת FAM-YVAD-FMK חיובית. ייצג את רמת הפעלת קספאז-1 כאחוז התאים החיוביים FAM-YVAD-FMK.
