זיהוי הפעלה דלקתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. קציר מח עצם

1. להסיר את עצם הירך ואת השוקה מעכבר ולנקות את העצמות באמצעות מכשירים סטריליים. מניחים את העצמות המנוקות במדיום Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) + 0.2 מ"ג/מ"ל L-גלוטמין + 0.05 מ"מ 2-מרקפטואתנול + 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין סולפט + 10,000 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין + 10% סרום בקר עוברי (FBS, DMEM-10 מלא) ודגור על הצינור על קרח למשך 15 דקות.
2. הסר את מפרקי הכדור הפרוקסימלי והדיסטלי באמצעות מספריים. הכנס מחט 25 גרם המחוברת מזרק 10 מ"ל מלא בינוני לתוך שקע העצמות. שטפו את מח העצם באמצעות DMEM-10 מלא. השהה מחדש את כל הגושים על ידי פיטום המדיום למעלה ולמטה בעדינות.
3. צנטריפוגה את התאים במשך 10 דקות ב 300 x גרם ולספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר. בשלב זה, או להקפיא את התאים באמצעות 90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) או צלחת את התאים בצלחת פטרי 15 ס"מ כדי להתמיין מקרופאגים באמצעות L929 מותנה תווך (שלב 2.1).

2. התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם

1. באמצעות אמצעי התמיינות שחומם מראש (21 מ"ל של DMEM-10 שלם ו-9 מ"ל של תווך מותנה תאי L929 כמתואר על ידי סוונסון ואחרים), הכניסו תאי מח עצם לצלחת פטרי בתרבית שאינה מטופלת בתרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ (1.2-1.5 x 10⁷ תאים). לדגור על הצלחת ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני, או CO₂ במשך 7 ימים. הוסף 30 מ"ל נוספים של מדיום בידול לצלחת ביום 3 או 4.
   הערה: חשוב לא להשתמש בצלחות שטופלו בתרבית רקמה, מכיוון שיהיה קשה לנתק ולקצור מקרופאגים.
2. כדי לאסוף מקרופאגים, לשטוף את הצלחת עם מלוחים חוצץ פוספט (PBS) ולהוסיף 20 מ"ל של PBS קר + 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך 10 דקות. קצור את התאים על ידי pipeting PBS + EDTA מעל התאים ושטיפת הצלחת עם 10 מ"ל של PBS. ערבבו את שתי השטיפות לשני צינורות חרוטיים, בנפח 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום + 5 mM HEPES + 0.2 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה Coulter. שמור את התאים על קרח במהלך הספירה.
4. זרעו את המקרופאגים בצלחות מצופות תרבית רקמה בגודל 2 x 10⁵ תאים/מ"ל. לניסויים במיקרוסקופיה, זרעו 1 מ"ל של תאים על כיסויים ב-24 צלחות באר. עבור מבחני שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH), זרע 100 μL של תאים בצלחת 96 בארות. עבור בדיקת LDH, זרע 9 בארות (3 בארות לא מטופלות, 3 בארות עם 100% בקרות ליזיס, ו 3 בארות עבור גירוי ניסיוני).
5. צנטריפוגה את צלחת 96 בארות במשך 5 דקות ב 300 x גרם כדי לוודא את התאים מפוזרים באופן שווה על פני הבאר.
6. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C + 5% CO₂ לפני תחילת תהליך הפריימינג.

3. פריימינג

1. החלף את המדיום בתווך טרי (DMEM-5) המכיל 100 ננוגרם/מ"ל ליפופוליסכריד או LPS (500 מיקרוליטר עבור צלחת 24 בארות או 50 מיקרוליטר עבור צלחת 96 בארות).
   הערה: ישנם מגוון שינויים מבניים ב- LPS, המשפיעים על היכולת לעורר פרימינג בתיווך TLR4. LPS מסלמונלה מינסוטה R595 (Re) זמין ממספר ספקים ומומלץ.
2. לדגור על הצלחת במשך 3 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.

4. הפעלה של NLRP3 Inflammasome עם Nigericin ותיוג עם FAM-YVAD-FMK

1. הסר את המדיום והחלף אותו עם 290 μL של DMEM-5 המכיל 5 מיקרומטר nigericin ו 5 mM גליצין. גליצין מתווסף כדי להפחית את כמות הליזה התאית המתרחשת במהלך הפעלת קספאז-1. יש לדגור במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. השתמשו הן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 והן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 כדי להבטיח שהסימון שנצפה הוא ספציפי לקספאז-1.
2. במהלך 45 הדקות האחרונות, להוסיף 10 μL של 30x FAM-YVAD-FMK, מוכן על פי הוראות היצרן.
3. לאחר 60 דקות, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS קר.
4. הוסיפו 250 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד לכל באר ודגרו על קרח מכוסה ברדיד אלומיניום למשך 30 דקות.
5. במהלך 5 הדקות האחרונות, הוסף 4 μL של 0.2 mM כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדום רחוק כדי לסמן את הגרעינים. 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), או צבעים אחרים יכולים לשמש גם כדי לתייג DNA.
6. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS קר והרכיבו את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה 7 μL נגד דהייה. הניחו למדיום ההרכבה להתקשות למשך הלילה לפני שאיטום הכיסוי למיקרוסקופ החליק באמצעות לק.
7. דמיינו את המקרופאגים במיקרוסקופ קונפוקלי. Ex/Em עבור FAM-YVAD-FMK הוא 492/520nm ו- 642/661 עבור כתם חומצת גרעין פלואורסצנטי אדום רחוק. הקפידו להגדיר את המיקרוסקופ כך שתאים לא מטופלים לא יראו שום צביעת רקע בערוץ 488. אחרת, צביעת רקע FAM-YVAD-FMK תתגלה ולא קספאז-1 פעיל בפועל.

5. הדמיה של מקרופאגים מסומנים במיקרוסקופ קונפוקלי

הערה: ניתן לצפות בתאים המוכתמים לאחר שהכיסויים הורשו להחלים במהלך הלילה ואטמו לשקופית המיקרוסקופ עם לק. כאן מתוארת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ניתן לצפות בתאים גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.

1. הניחו את השקף עם תאי הבקרה הלא מטופלים על במת המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ בתאים.
2. באמצעות הגדרות טבלת חיפוש במיקרוסקופ (LUT), התאם את ההיסט כך שלא תהיה צביעת FAM-YVAD-FMK חיובית בתאים שלא טופלו. תהליך זה יכול להתבצע גם באמצעות מקרופאגים חסרים קספאז-1.
   הערה: יש להתאים את ההיסט לכל ערוץ המשמש בניסוי, אך הגדרת ההיסט הנכון היא קריטית ביותר עבור ערוץ FAM-YVAD-FMK ותעלות נוגדנים פלואורסצנטיים. הקיזוז של ערוץ הדנ"א פחות קריטי. לאחר הגדרת ההיסט, אל תתאים הגדרה זו לשאר הניסוי.
3. העבר את השקופית לדגימה שטופלה בניגריצין. מצא שדה המכיל את שני התאים החיוביים והשליליים עבור צביעת FAM-YVAD-FMK. התאם את מישור ההדמיה של ערוץ FAM-YVAD-FMK למישור בעל העוצמה הגבוהה ביותר של צביעה חיובית. זה יהיה בדרך כלל המישור שבו מרכז המוקד הדלקתי מצולם.
4. התאימו את הרווח כך שהמוקדים ייראו בתאים בעלי גרעינים מעובים. לאחר הגדרת הרווח וההסטה, השאר הגדרות אלה להמשך הפעלת ההדמיה.
   הערה: דרך קלה אחת לקבוע אם תא הוא פירופטוטי היא על ידי התבוננות במורפולוגיה גרעינית. לתאים עם קספאז-1 פעיל יש גרעינים מעוגלים ומעובים, בעוד שגרעינים נראים בתאים ללא הפעלת קספאז-1 והמורפולוגיה הגרעינית דומה לזו של תאים לא מטופלים.
5. אסוף תמונות של 5 שדות שנבחרו באופן אקראי בהגדלה כוללת של 100X. התוצאה תהיה בדרך כלל כ-40 תאים לכל תמונה. חזור על תהליך זה עבור כל דגימה.
6. ספור את מספר התאים בכל תמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. לאחר מכן ספור את מספר התאים שיש להם צביעת FAM-YVAD-FMK חיובית. ייצג את רמת הפעלת קספאז-1 כאחוז התאים החיוביים FAM-YVAD-FMK.