$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם
- באמצעות אמצעי התמיינות שחומם מראש (21 מ"ל של DMEM-10 שלם ו-9 מ"ל של תווך מותנה תאי L929 כמתואר על ידי סוונסון ואחרים), הכניסו תאי מח עצם לצלחת פטרי בתרבית שאינה מטופלת בתרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ (1.2-1.5 x 107 תאים). לדגור על הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 7 ימים. הוסף 30 מ"ל נוספים של מדיום בידול לצלחת ביום 3 או 4.
הערה: חשוב לא להשתמש בצלחות שטופלו בתרבית רקמה, מכיוון שיהיה קשה לנתק ולקצור מקרופאגים.
- כדי לאסוף מקרופאגים, לשטוף את הצלחת עם מלוחים חוצץ פוספט (PBS) ולהוסיף 20 מ"ל של PBS קר + 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך 10 דקות. קצור את התאים על ידי pipeting PBS + EDTA מעל התאים ושטיפת הצלחת עם 10 מ"ל של PBS. ערבבו את שתי השטיפות לשני צינורות חרוטיים, בנפח 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום + 5 mM HEPES + 0.2 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה Coulter. שמור את התאים על קרח במהלך הספירה.
- זרעו את המקרופאגים בצלחות מצופות תרבית רקמה בגודל 2 x 105 תאים/מ"ל. לניסויים במיקרוסקופיה, זרעו 1 מ"ל של תאים על כיסויים ב-24 צלחות באר. עבור בדיקות שחרור LDH, זרע 100 μL של תאים בצלחת 96 באר. עבור בדיקת LDH, זרע 9 בארות (3 בארות לא מטופלות, 3 בארות עם 100% בקרות ליזיס, ו 3 בארות עבור גירוי ניסיוני).
- צנטריפוגה את צלחת 96 בארות במשך 5 דקות ב 300 x גרם כדי לוודא את התאים מפוזרים באופן שווה על פני הבאר.
- יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C + 5% CO2 לפני תחילת תהליך הפריימינג.
2. פריימינג
- החלף את המדיום בתווך טרי (DMEM-5) המכיל LPS של 100 ננוגרם/מ"ל (500 מיקרוליטר עבור צלחת 24 בארות או 50 מיקרוליטר עבור צלחת 96 בארות).
הערה: ישנם מגוון שינויים מבניים ב- LPS, המשפיעים על היכולת לעורר פרימינג בתיווך TLR4. LPS מסלמונלה מינסוטה R595 (Re) זמין ממספר ספקים ומומלץ.
- לדגור על הצלחת במשך 3 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
3. הפעלה של NLRP3 Inflammasome עם Nigericin
- הסר את המדיום והחלף אותו עם 290 μL של DMEM-5 המכיל 5 מיקרומטר nigericin ו 5 mM גליצין. גליצין מתווסף כדי להפחית את כמות הליזה התאית המתרחשת במהלך הפעלת קספאז-1. יש לדגור במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. השתמשו הן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 והן במקרופאגים עם מחסור בקספאז-1 כדי להבטיח שהסימון שנצפה הוא ספציפי לקספאז-1.
- לאחר 60 דקות, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS קר.
4. צביעת נוגדנים
הערה: כדי לתייג את התאים עם נוגדנים כדי לזהות ASC, זרע, ראשוני ולחשוף את התאים לניגריצין זהה לסעיף הקודם. העיבוד לאחר מכן הוא כדלקמן:
- לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS קר. הוסף 250 μL של פתרון קיבוע וחדירה. דוגרים על התאים על קרח, ומכסים במשך 30 דקות.
- שטפו את המקרופאגים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה.
- הוסף 250 μL של נוגדן ראשוני נגד ASC מדולל 1:500 בחיץ כביסה ודגרה במשך 1 שעה על קרח. כלול כיסוי אחד שאינו מקבל נוגדן ראשוני, אלא יקבל רק את המשני. כיסוי זה ישמש במהלך הגדרת המיקרוסקופ כדי להגדיר את ההיסט הנכון.
- שטפו את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם חיץ כביסה של 1 מ"ל.
- מוסיפים 250 μL של נוגדן משני (צבע פלואורסצנטי מצומד עז נגד עכבר) מדולל 1:500 בחיץ כביסה ודגרים במשך שעה על קרח. הוסף 4 μL של 0.2 mM כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדום רחוק במשך 5 הדקות האחרונות של דגירה זו כדי לסמן גרעינים.
- שטפו את התאים 3x עם 1 מ"ל של חיץ לשטיפה קרה והרכיבו את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה 7 μL נגד דהייה. הניחו למדיום ההרכבה להתקשות למשך הלילה לפני שאיטום הכיסוי למיקרוסקופ החליק באמצעות לק שקוף.
- תמונה מקרופאגים במיקרוסקופ קונפוקלי. Ex/Em עבור הנוגדן המשני הוא 555/580 ננומטר ו- 642/661 עבור כתם חומצת הגרעין הפלואורסצנטי האדום רחוק.