בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז לאיתור מוות מקרופאגים בעקבות חשיפה לניגריצין

תקציר

מקור: den Hartigh, A.B. et al., Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את בדיקת לקטט דהידרוגנאז לזיהוי מוות של מקרופאגים בתיווך דלקת. המקרופאגים נחשפים לליפופוליסכריד לצורך פרימה, ולאחר מכן חשיפה לניגריצין גורמת למוות תאי הנגרם על ידי דלקת, אשר נקבע על ידי בדיקת לקטט דהידרוגנאז.

פרוטוקול

1. בדיקת שחרור LDH

הערה: עבור בדיקת שחרור LDH, זרעו את התאים בצלחת של 96 בארות. אין להסיר את המדיום לאחר הפריימינג.

1. החלף את המדיום בתווך טרי (DMEM-5: 10 מ"ל של DMEM נטול פנול-אדום + 5 מ"מ HEPES + 0.2 מ"ג/מ"ל L-גלוטמין + 0.05 מ"מ 2-מרקפטואתנול + 5% FBS) המכיל LPS של 100 ננוגרם/מ"ל בבארות המכילות תאי מקרופאגים דבקים (500 מיקרוליטר עבור לוחות 24 בארות או 50 מיקרוליטר עבור לוחות 96 בארות).
   הערה: ישנם מגוון שינויים מבניים ב- LPS, המשפיעים על היכולת לעורר פרימינג בתיווך TLR4. LPS מסלמונלה מינסוטה R595 (Re) מומלץ.
2. לדגור על הצלחת במשך 3 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
3. הוסף 50 μL של DMEM-5 המכיל 10 μM nigericin לבארות הניסוי ו 50 μL DMEM-5 לבארות הבקרה הספונטניות ו -100% ליזיס. יש לדגור במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
4. לאחר 30 דקות, הוסף 10 μL של חיץ ליזיס 10x לבארות בקרת ליזה 100% והוסף 10 μL של DMEM-5 לבארות האחרות. במהלך הדגירה הזו, הסר בקבוקון אחד של תערובת המצע (1.5 מ"ל של מצע מיובש בהקפאה) ו 1 aliquot של חיץ assay (~ 12 מ"ל) מהמקפיא ולתת להם להפשיר מוגן מאור לטמפרטורת החדר.
   הערה: תערובת המצע מכילה מלח טטרזוליום (יודוניטרוטטרזוליום סגול), המומר למוצר פורמזן אדום.
5. לאחר הדגירה הכוללת של 60 דקות, צנטריפוגו את הצלחת למשך 5 דקות ב 500 x גרם ב 10 ° C. מעבירים 50 μL של supernatant לצלחת שטוחה שקופה. במהלך תקופה זו, יש להוסיף 12 מ"ל של חיץ בדיקה לבקבוקון תערובת המצע ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני השימוש.
6. מוסיפים 50 מיקרוליטר מצע לכל באר ודגרים במשך 30 דקות בחושך. כלול בארות בינוניות בלבד עבור ערכים ריקים. בדוק את הצלחת לאחר 15 דקות כדי לוודא שהאות לא יחרוג ממגבלת הזיהוי של קורא הלוחות.
7. לאחר 30 דקות, הוסף 50 μL של תמיסת עצירה (1 M חומצה אצטית) ולמדוד OD₄₉₀ באמצעות קורא לוחות.
8. חשב את אחוז ליזה התא באמצעות הנוסחה הבאה:
   % ציטוטוקסיות = ((ניסיוני - ספונטני)/(מקסימום - ספונטני))×100
   ניסיוני: תאים שטופלו בניגריצין; ספונטני: תאים לא מטופלים; מקסימום: תאים שנחשפו לחיץ ליזיס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית Cytotox96	פישר סיינטיפיק	PR-G1780	כולל תמהיל מצע וחיץ מבחן; ניסוחים קנייניים. תמיסת עצירה היא 1 M חומצה אצטית
DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום	Invitrogen	31053028
PBS של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום	Invitrogen	14190144
סרום בקר עוברי, מוסמך, מוצא בארה"ב	Invitrogen	26140079	מנוטרל בחום ב-55°C למשך 50 דקות
גנטמיצין	Invitrogen	15750060
LPS טהור במיוחד מסלמונלה מינסוטה R595 (Re)	רשימה ביולוגית	434
קורא לוחות Spectramax M3	התקנים מולקולריים	5000414
ל-גלוטמין	Invitrogen	21051024