$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. בידוד נויטרופילים בריאים
- להשיג 20 מ"ל של דם היקפי מתורם בריא בשתי צינורות מצופים 10 מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
- שים 10 מ"ל של דם בצינור סטרילי 50 מ"ל והוסף מלח חוצץ פוספט (PBS) עד 32.5 מ"ל.
- הוסף שיפוע צפיפות (למשל, Ficoll-amidotrizoaat) מתחת לתאים.
- קח 14 מ"ל של שיפוע צפיפות עם 10 מ"ל צינור בקר צינור
.
- מניחים את הצינור בתחתית הצינור 50 מ"ל.
- הסר את בקר הפיפט מהפיק, ואפשר לשיפוע הצפיפות לזרום החוצה מהצינור על ידי כוח הכבידה עד שיגיע למקסימום על ידי אפקט נימי (1-2 מ"ל יישאר), מבלי להשתמש במנוע.
- הסר את הצינור על ידי הנחת אגודל על גבי הפיפט, ובכך למנוע את דליפת שיפוע הצפיפות החוצה במהלך הסרת הפיפט.
- סובב את הצינורות במשך 20 דקות במהירות של 912 x גרם ובטמפרטורת החדר (RT) ללא האצה או בלימה.
הערה: לתאי דם אדומים (RBC) ולנויטרופילים יש צפיפות גבוהה והם נמצאים בתחתית הצינור של 50 מ"ל. תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מופרדים ועל גבי שיפוע הצפיפות כטבעת לבנה. פלזמה מדוללת PBS תהיה מעל PBMCs. במידת הצורך, ניתן לבודד PBMCs על ידי העברת הטבעת הלבנה לצינור חדש של 50 מ"ל עם שלבי שטיפה נוספים עם מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הסר בזהירות את הטבעת הלבנה המכילה PBMCs תחילה, לאחר מכן הסרת הפלזמה המדוללת ב- PBS, ולבסוף את שכבת שיפוע הצפיפות ככל האפשר.
- כדי לבודד נויטרופילים מן נויטרופילים / אריתרוציטים לערבב, אריתרוציטים lyse עם מים מזוקקים סטריליים קרים.
- קחו מהמקרר בקבוק מים מזוקקים סטריליים קרים ובקבוק PBS מרוכז פי 10.
- עבוד במהירות עבור שלב זה. מוסיפים 36 מ"ל מים מזוקקים סטריליים קרים ישירות על גבי הגלולה ומערבבים פעם אחת בזהירות. הוסף 4 מ"ל של PBS 10x לאחר 20 שניות כדי ליצור תמיסה איזוטונית. מערבבים פעם אחת בזהירות.
- צינור סחיטה במשך 5 דקות ב 739 x גרם ו 4 ° C (להסרת RBCs). נויטרופילים יהיו בגלולה הלבנה.
- בזהירות להשליך את supernatant. בצע שוב את שלב 1.6.2 וודא שהגלולה תלויה כראוי.
- צינור סחיטה במשך 5 דקות ב 328 x גרם ו 4 ° C.
- בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 5 מ"ל של PBS. ספרו את הנויטרופילים ושמרו אותם על קרח.
הערה: התשואה הצפויה מצינור דם אחד (10 מ"ל) היא כ-15-75 מיליון נויטרופילים.
2. תיוג תאים פלואורסצנטיים אדומים של נויטרופילים
- בצע תרחיף נויטרופילים של 10-20 מיליון נויטרופילים ב 2 מ"ל של PBS בצינור 15 מ"ל.
- צור תמיסה של PBS של 2 מ"ל עם 4 μL של 2 מיקרומטר מקשר תאים פלואורסצנטיים אדומים (ראה טבלת חומרים) בצינור אחר של 15 מ"ל. הוסיפו זאת בעדינות לתרחיף הנויטרופילים וערבבו בזהירות.
- דגרו בחושך במשך 25 דקות בדיוק בטמפרטורה של 37°C כדי לסמן את הנויטרופילים במקשר התאים הפלואורסצנטי האדום.
- בטל את הסימון על ידי הוספת מדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ב- RT עד 15 מ"ל וערבב פעם אחת בזהירות. ודא כי הגלולה הוא resuspended בזהירות אם גלולה נוצרה.
- Spin tube במשך 5 דקות ב 328 x g ו RT.
- הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 5 מ"ל של פנול אדום ללא RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FBS ו 10% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב RT. לספור את הנויטרופילים.
הערה: אובדן תאים של 50% יכול להתרחש לאחר תיוג תאים פלואורסצנטיים אדומים.
3. השראת היווצרות מלכודת חוץ-תאית של נויטרופילים
- בצע תרחיף תאים של 0.42 x 106 תאים/מ"ל בתווך פנול ללא אדום RPMI 1640 המכיל 2% FBS ו -10% P/S.
- הוסיפו 37,500 נויטרופילים ב-90 מיקרוליטר לבאר בלוח תחתון שחור שטוח בעל 96 בארות.
- הוסף 10 μL של הגירוי שנבחר (למשל, סרה של מטופל) במשולש כדי להגיע לריכוז של 10% בבאר. כלול תמיד בקרה שלילית (בינונית) במשולש.
- יש לדגור בחושך ב-37°C לזמן הרצוי, בין 30 דקות ל-2, 4 או 6 שעות. מומלץ לדגור במשך 4 שעות.
- חשב את הנפח הדרוש כדי להוסיף 25 μL של 5 מיקרומטר צבע DNA בלתי חדיר (ראה טבלת חומרים), כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבאר. בצע דילול במידת הצורך, בתווך RPMI 1640 המכיל 2% FBS ו- 10% P/S לקבלת ריכוז של 5 מיקרומטר.
- הוסף 25 μL של 5 μM צבע DNA בלתי חדיר 15 דקות לפני סוף זמן הדגירה. המשך הדגירה עוד 15 דקות ב 37 ° C בחושך.
- הסר את supernatant (~ 125 μL) בזהירות רבה ואחסן אותו במידת הצורך. הוסף 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA). הישאר בחושך, ומיד המשך לשלב 4.
4. מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NET) ויזואליזציה עם תלת-ממד תוכן גבוה, ברזולוציה גבוהה Immunofluorescence Confocal Microscopy
- הגדר את ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence על ידי לחיצה על הגדרת רכישה.
- לחץ על הכרטיסייה תצורה.
- בחר את המטרה ואת המצלמה. בחר את המטרה 10X Apo Lambda עם מצב רכישה של חור סיכה קונפוקלי של 60 מיקרומטר.
- לחץ על צלחת ובחר צלחת פלסטיק 96 בארות. בחר את האתרים שבהם ברצונך לבקר ובחר מספר קבוע של אתרים. מלאו 3 עמודות ו-3 שורות ללא חפיפה (0 מיקרומטר), המכסות בסך הכל 45% מהבאר.
- לחץ על רכישה. בחר Enable Laser-based focusing. בחר באפשרות Purchase Z Series/Time Series במידת הצורך.
- לחץ על מיקוד אוטומטי באתר.
- לחץ על פוקוס על תחתית הצלחת | מנותק לפי עובי תחתון. עבור הבאר הראשונית כדי למצוא את המדגם, לבחור את הראשון נרכש היטב. עבור המיקוד האוטומטי של האתר, בחר כל האתרים.
- לחץ על אורכי גל.
- עבור מספר אורכי הגל, בחר 2. לרמת עידון תיקון הצללת TL, בחר 2.
- עבור אורך גל 1, בחר Texas Red.
- לאפשרויות המיקוד האוטומטי, בחר לייזר עם היסט Z, לאחר הסטת לייזר 1.1 מיקרומטר. השתמש בערימת Z עם טווח מותאם אישית של 200-10.
- עבור אורך גל 2, בחר fluorescein isothiocyanate (FITC).
- לאפשרויות המיקוד האוטומטי, בחר לייזר עם הסטת Z מ- w1 0 μm. השתמש ב- Z-stack עם טווח מותאם אישית של 200-10.
- לאפשרויות הרכישה, בחר סדרת Z ותמונת הקרנה דו-ממדית מרבית. עבור אפשרויות הרכישה, בחר תיקון הצללה | כבוי.
- בחר סדרה Z. בחר את מספר השלבים: 10. בחר את גודל המדרגה: 3 מיקרומטר (הטווח הכולל יהיה 27 מיקרומטר).
- שים את הצלחת במיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence.
- לחץ על הכרטיסייה הפעלה.
- מלא את שם הלוחית ותיאורה ובחר את מיקום האחסון.
- בחר את הבארות שיש לרכוש.
- בחר זמן חשיפה עבור Texas Red ו- FITC.
- לחץ על Purchase Plate כדי להתחיל את הרכישה, אשר ייקח בערך 1 שעה לכל צלחת.
5. ניתוח היווצרות נטו
- השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המיועדת לניתוח תמונות מדעיות רב-ממדיות (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח היווצרות NET.
- העבר את נתוני התמונה שנרכשו לכונן קשיח נפרד.
- בחרו בכלי הוספת צבע.
- בחר w1 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו מאוחסנים הנתונים.
- בחר w2 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבה מאוחסנים הנתונים.
הערה: השתמש במאקרו רגיל המשתמש ב- w1 בשם הקובץ כדי להוסיף צבע אדום לתמונות טקסס אדום ומשתמש ב- w2 כדי להוסיף צבע ירוק לתמונות FITC.
- בחר ניתוח מאקרו.
- בחר w1 ובחר בערך הסף (סף עוצמה), שהוא בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (סף גודל, לדוגמה, 100).
- בחר w2 ובחר בערך הסף (סף עוצמה), שהוא בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (סף גודל, לדוגמה, 500).
- בחר את היעד עבור קובץ הגיליון האלקטרוני, הפעל את הניתוח ושמור קובצי יומן לאחר מכן.
- ניתוח נתונים בגיליון אלקטרוני.