בידוד שומנים מנויטרופילים שמקורם בדם אנושי על ידי הפרדה ביפאזית

תקציר

מקור: Brogden, G., et al. שיטות לחקר שינויים בשומנים בנויטרופילים והיווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים בידוד שומנים מנויטרופילים אנושיים על ידי מערכת ממס דו-פאזית באמצעות מתנול וכלורופורם.

פרוטוקול

1. בידוד שומנים וניתוח של נויטרופילים שמקורם בדם אנושי

1. קחו נויטרופילים והניחו אותם על קרח.
2. על הקרח, פיפטה את הנויטרופילים (הנמצאים בתמיסת מתנול וכלורופורם) לצינור זכוכית בעל מכסה בורג של 15 מ"ל עם חותם פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) והומוגניזציה שלהם על ידי ניעור במשך דקה אחת. השתמש בצינורות זכוכית כדי למנוע מהשומנים להיקשר למשטחי פלסטיק. יש להשתמש במכסי PTFE למניעת זיהום מגומי/פלסטיק.
3. מוסיפים 2 מ"ל מתנול ודקה לאחר מכן 1 מ"ל כלורופורם. נערו שוב במשך דקה.
4. סובב את צינורות הזכוכית ב-RT וב-50 סל"ד למשך 30 דקות.
5. פולט את חלק החלבון על ידי צנטריפוגה של התמיסה ב 7 ° C ו 1,952 x גרם במשך 10 דקות.
6. מרוקנים בזהירות את הסופרנאטנט לתוך צינור חדש של פקק בורג זכוכית בנפח 15 מ"ל, ומשאירים מאחור את הגלולה המכילה חלבון. אחסנו את הגלולה בטמפרטורה של -20°C לכימות עתידי.
7. מוסיפים 1 מ"ל כלורופורם, ממתינים דקה, מוסיפים 1 מ"ל מים מזוקקים כפול והופכים את צינור פקק בורג הזכוכית עם הדגימה למשך 30 שניות.
8. צנטריפוגה בטמפרטורה של 7°C ו-1,952 x g למשך 10 דקות והשליכו את השלב העליון, עד לשכבה המעוננת, אך לא כולל.
9. במידת הצורך, בצע שלב טיהור נוסף אופציונלי על-ידי חזרה על שלב 1.1.8.
10. יבשו את הדגימות ברכז ואקום בטמפרטורה של 60°C ואחסנו אותן בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 10 μl	המילטון	701 NR 10 μl
קנולה 26 גרם	בראון	4657683
כלורופורם	קרל רות'	7331.1
מתנול	קרל רות'	7342.1
מים	קרל רות'	3255.1	ללא אנדוטוקסין