בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז לזיהוי זיהום Cryptococcus neoformans במקרופאגים

תקציר

מקור: Ball, B., et al. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת ציטוטוקסיות כדי להעריך Cryptococcus neoformans, פטרייה פתוגנית, זיהום במקרופאגים. ציטוטוקסיות נקבעת על ידי שחרור של אנזים cytoplasmic lactate dehydrogenase עקב ליזה מקרופאג הנגרמת על ידי זיהום Cryptococcus neoformans.

פרוטוקול

1. אימות זיהום

הערה: באמצעות בדיקת ציטוטוקסיות, ניתן למדוד מיומנות זיהום. הפרוטוקול הבא ידגיש את היישום של מוצר ציטוטוקסיות למדידת שחרור LDH (לקטט דהידרוגנאז). ניתן להשתמש גם במוצרים ציטוטוקסיים אחרים

1. הכנת זיהום C. neoformans של תאי מקרופאג
   1. הכנת תאים פטרייתיים
      1. בעזרת ציר גליצרול, פזרו זן Wildtype C. neoformans (H99) על צלחת אגר מסוג פפטון דקסטרוז (YPD) עם תמצית שמרים כדי לבודד מושבות בודדות.
      2. לדגור לילה במשך 16 שעות ב 37 ° C באינקובטור סטטי.
      3. בחר מושבה אחת של זן ותרבית פרא מסוג C. neoformans ב 5 מ"ל של מרק YPD במבחנה 10 מ"ל מכוסה באופן רופף. בצע ב quadruplicate.
      4. דוגרים לילה במשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-200 סל"ד.
      5. למחרת תת-תרביות כל תרבית לילה בדילול של 1:100 למרק YPD של 3 מ"ל.
      6. מדוד ערכי צפיפות אופטית (OD_600nm) של תרבית פטרייתית כדי לקבוע את שלב אמצע הרישום. בהתאם לספקטרופוטומטר, זן הבר C. neoformans מגיע לשלב אמצע לוג בדרך כלל לאחר דגירה של 6 עד 8 שעות ב- YPD עם ערכי OD כלליים_{של 600nm} הנעים בין 1.0 ל- 1.5.
      7. ברגע שהתאים מגיעים לשלב אמצע הלוג, קחו אליציטוט של 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים פטרייתי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל ודללו 1:100 במי מלח סטריליים 1x חוצץ פוספט (PBS). לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
      8. אספו תאי צנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם במשך 10 דקות, שטפו בעדינות את הגלולה עם PBS סטרילי בטמפרטורת החדר, וחזרו על הפעולה במשך שלוש שטיפות בסך הכל.
      9. תאי השהיה מחדש בתווך תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה כדי להשיג ריכוז של 1.2 x 10⁸ תאים / מ"ל.
   2. הכנת תאי מקרופאגים
      1. דמיינו כל באר בצלחת 6 בארות כדי להבטיח שהתאים הגיעו למפגש של 70-80%. לחלופין, ניתן למדוד תאים כדי להשיג כ 1.2 x 10⁶ תאי מקרופאג לכל באר.
      2. תוספת אנטיביוטיקה חמה בינונית עד 37 מעלות צלזיוס לפני עבודת תרבית תאים. יש לוודא שסביבת העבודה מעוקרת לפני עבודת תרבית תאים. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהתאים דבקים ובריאים.
      3. הסר את מדיום תרבית התאים מן הצלחת או עם פיפטה סרולוגית או שואב ואקום.
      4. הוסיפו בעדינות 5-7 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר (מלוחים חוצצי פוספט) לצלחת בגודל 60 x 15 מ"מ.
      5. הטו בעדינות את הכלי כדי לשטוף תאים דבוקים.
   3. תרבית משותפת של C. neoformans ותאי מקרופאגים
      1. הוסף 1 מ"ל של תאי C. neoformans מרחפים ל -4 בארות המכילות תאי מקרופאגים.
         הערה: יהיה צורך לחשב את מספר הלוחות הנדרש לפני תחילת הניסוי. הוסף 1 מ"ל של בארות בינוניות ללא אנטיביוטיקה לבארות ריקות.
      2. אפשר לתאים לדגור ב-37°C עם 5% CO₂ למשך 3 שעות.
      3. הסר את מדיום תרבית התא מהצלחת או עם פיפטה סרולוגית או שואב ואקום.
      4. הוסיפו בעדינות 1 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
      5. הטו בעדינות את הצלחת כדי לשטוף תאים חוץ-תאיים מסוג C. neoformans שאינם מחוברים או שאינם פגוציטוזים.
      6. הוסף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה לכל באר בצלחת 6 בארות.
      7. לדגור על תאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
   4. בנקודות זמן נבחרות (למשל, 1, 3, 6, 12 ו-24 שעות) יש לאסוף סופרנאטנט למדידת שחרור LDH בהתאם להוראות היצרן.
   5. באותן נקודות זמן, תאי מקרופאגים לא נגועים יעברו ליזה לערך שנקבע עבור ציטוטוקסיות מרבית.
   6. חשב ציטוטוקסיות באופן הבא:
      

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	פישר סיינטיפיק	BP152-1	יש לשמור על טמפרטורה של 4°C
צלחת 60 x 15 מ"מ, דלתא של נונקלון	תרמופישר סיינטיפיק	174888
צלחת תרבית תאים 6 בארות	תרמופישר סיינטיפיק	140675
צינורות בז חרוטי (15 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	05-539-12
מונה תאים אוטומטי של הרוזנת השנייה	תרמופישר סיינטיפיק	AMQAX1000	לא חיוני, המוציטומטר יכול לשמש כחלופה.
CytoTox 96 בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית	פרומגה	G1780
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX	תרמופישר סיינטיפיק	10566016
סרום בקר עוברי (FBS)	תרמופישר סיינטיפיק	12483020	יש לחמם על ידי דגירה בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות. מכינים 50 מ"ל aliquots להקפיא בזק. הפשרה לפני הכנה לתקשורת
המוציטומטר	VWR	15170-208
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H3375	יש להכין 40 mM HEPES/8 M Urea בתמיסת מלאי בתפזורת, להקפיא בזק, לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
ל-גלוטמין	תרמופישר סיינטיפיק	25030081	יכול להיות aliquot וקפוא לאחסון. הפשרה לפני הכנה לתקשורת.
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	13864457
פניצילין : סטרפטומיצין 10k/10k	VWR	CA12001-692	יכול להיות aliquot וקפוא לאחסון. הפשרה לפני הכנה לתקשורת.
מלח חוצץ פוספט	VWR	CA12001-676	אין צורך ברכישה. ניתן גם להכין PBS אך יש לבצע סינון סטרילי לפני השימוש.
פיפטה, סרולוגית חד פעמית (10 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	13-678-11E
פיפטה, חד פעמית סרולוגית (25 מ"ל) Basix	פישר סיינטיפיק	14955235
תערובת פרוטאז טריפסין/Lys-C, כיתה טרשת נפוצה	פירס	A40007	יש לשמור על טמפרטורה של -20°C.
אוריאה	סיגמא אולדריץ'	U1250-1 ק"ג	הכן 40 mM HEPES/8 M Urea בתמיסת מלאי בתפזורת, הבזק קפוא, לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. יש להשליך לאחר כל שימוש (אין להקפיא-להפשיר שוב ושוב).
תמצית שמרים פפטון דקסטרוז מרק	BD Difco	BM20