מערכת זיהום חדירה המבוססת על החדרת ממברנה לחקר ההשפעה של רעלנים חיידקיים

Abstract

מקור: Flaherty, R. A., et al. יישום מערכת זיהום מבוססת ממברנה חדירה לחקר ההשפעות של רעלני חיידקים מופרשים על תאי פונדקאים של יונקים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים מערכת זיהום חדירה המבוססת על החדרת קרום כדי להעריך את ההשפעה של רעלנים חיידקיים מופרשים. על ידי ביטול מגע ישיר בין הפתוגן החיידקי לבין התאים המארחים באמצעות קרום חדיר, טכניקה זו מאפשרת לחקור את ההשפעה של רעלים המופרשים על ידי חיידקים פתוגניים על תאים מארחים יונקים.

Protocol

1. תרבית חיידקים

1. יצירת זנים מוטנטיים איזוגניים שישמשו לחקר הגורם המופרש הספציפי.
   הערה: זני GAS (סטרפטוקוקוס מקבוצה A) M1T1 5448 ששימשו לניסויים אלה כללו WT (סוג פראי) GAS', מוטנט SLS של חתול sagAΔ (sag = Streptolysin S associated gene, SLS = Streptolysin S) מוטנטי (מקוצר בטקסט כ-ΔsagA), וזן משלים sagA (מקוצר בטקסט כ-ΔsagA+sagA).
2. הכינו במשך הלילה תרביות נוזליות של זני חיידקים מעניינים. לגדל זני גז M1T1 5448 ב-10 מ"ל מרק טוד-יואיט בטמפרטורה של 37°C למשך 16-20 שעות לפני הדבקת תאים אנושיים.
3. צנטריפוגה לילה תרביות חיידקים (2,400 rcf למשך 10 דקות) והשעיה מחדש בתווך חיידקים טריים.
   הערה: מתלה באותו נפח שבו גדלו תרביות הלילה (5-10 מ"ל) מייצר בדרך כלל צפיפות אופטית התחלתית רצויה.
4. נרמל תרביות חיידקים לריכוזים התחלתיים שווים על ידי דילול התרביות המרחפים מחדש בתווך חיידקי נוסף עד לקבלת אותה צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD₆₀₀) לכל הזנים לבדיקה (OD₆₀₀ של כ- 1.0 מומלץ לנוחות).
   הערה: במחקרים אלה נעשה שימוש בתרביות חיידקים בשלב נייח כדי להדביק תאים מארחים מיד לאחר הנורמליזציה. עם זאת, מכיוון שזנים מסוימים של חיידקים יוצאים מהפאזה הנייחת באופן לא סינכרוני, ייתכן שיהיה מתאים יותר להתחיל זיהומים של המאכסן עם תרביות בשלב היומן אם נמצא שזה המקרה עבור הזנים המעניינים.
5. לפני ניתוח נוסף, בצע בדיקת ספירת מושבות כדי לקבוע את יחידות יצירת המושבה (CFU) למיליליטר הקיימות בתרביות ההתחלתיות, כך שניתן יהיה לקבוע את ריבוי הזיהום (MOI), או יחס החיידקים לתא מארח.
   1. הכינו דילול סדרתי של 1 מ"ל של תרביות חיידקים שנורמלו לצפיפות האופטית הרצויה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או במדיום גידול חיידקים מתאים (מרק טוד-יואיט שימש במחקרים אלה). הכינו דילולים הנעים בין ^{10-1 ל-10-6} כדי לייצר לפחות סט אחד של צלחות אגר עם מושבות ניתנות לספירה, (30-300 מושבות). בצע את כל הדילולים בשלשה.
   2. מעבירים 100 μl מכל דילול סדרתי לצלחת אגר המכילה את התווך המתאים למיני החיידקים המנותחים.
      הערה: טוד-יואיט אגר שימש במחקרים אלה.
   3. השתמש במפזר חיידקים מזכוכית או פלסטיק כדי לפזר באופן שווה את 100 μl aliquot על פני כל פני השטח של צלחת האגר, ולהמשיך להתפשט עד שהנוזל נספג לתוך האגר. בצע תחת להבה בטכניקה סטרילית.
   4. לדגור על צלחות אגר ב 37 ° C במשך הלילה או עד מושבות ספירה מופיעות.
   5. ספרו את המושבות שגדלות על כל צלחת וחשבו את ה-CFU/ml בתרבות המקורית לפי הנוסחה הבאה: מספר מושבות x הופכי לנפח הדילול/תרבית הטורי המצופה במיליליטרים.
      לדוגמה (200 מושבות x 1/^10-5 דילול) / 0.1 מ"ל מצופה = 2.0 x 10⁸ CFU/ml.

2. תרבית תאים מארחת

1. השג קו תאים מארח מתאים עבור הניתוחים הרצויים.
   הערה: קרטינוציטים אפיתליאליים אנושיים HaCaT, מתנה חביבה מ V. Nizet, שימשו למחקרים אלה.
   1. שמרו על תאי HaCaT בצלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו עם 10% נסיוב בקר עוברי מומת בחום (FBS). יש לדגור ב-37°C עם 5% CO₂.

3. זיהום תאי מארח במערכת החדרת קרום חדירה

1. תאי צלחת בצלחות תרבית רקמה מתאימות ומאפשרים להם לגדול עד שהם מגיעים למפגש של 90%.
   הערה: תאי HaCaT המשמשים במחקרים אלה בדרך כלל מגיעים למפגש תוך 2-3 ימים לאחר הציפוי.
   1. עבור איסוף ליזט (למשל ניתוח איתות ובדיקות קביעת אדנוזין טריפוספט (ATP), צלחת תאי HaCaT ב 6 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 3 x 10⁵ תאים / באר.
   2. עבור ניסויי הדמיה אימונופלואורסצנטית, תאי צלחת על זכוכית סטרילית מכסים בתוך 6 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 3 x 10⁵ תאים / באר.
   3. עבור מבחני חדירות קרום אתידיום הומודימר ושחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH), צלחת תאי HaCaT ב -24 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 5 x 10⁴ תאים / באר.
2. מיד לפני הטיפול, לשטוף תאים עם PBS סטרילי 1x.
3. יש למרוח מדיום גידול טרי על תאים. עבור התנאים המתוארים כאן, להחיל 2 מ"ל בינוני לכל באר עבור 6 צלחות באר או 0.5 מ"ל בינוני לכל באר עבור 24 צלחות באר. אם נבדקים טיפולים תרופתיים, יש לערבב עם מדיום טרי ולמרוח במהלך שלב זה.
   הערה: בדיקות מסוימות עשויות לדרוש מדיה חלופית. לדוגמה, מכיוון שפנול אדום וריכוזים גבוהים בסרום מפריעים לבדיקת שחרור LDH, נעשה שימוש בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) ללא פנול אדום בתוספת אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) (w/v), 2 מילימטר L-גלוטמין ונתרן פירובט 1 מ"מ לניסויים אלה.
4. לאחר יישום מדיום טרי, מניחים בזהירות תוספת קרום סטרילית של 0.4 מיקרומטר חדירה בכל באר. בצע שלב זה במכסה מנוע זרימה למינרית, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הקרום החדיר לתוך כל באר.
5. יש למרוח מדיום תרבית תאים טרי על החדר העליון של כל באר בהתאם להוראות היצרן. עבור התנאים המתוארים כאן, להחיל 1 מ"ל בינוני לכל באר עבור 6 צלחות באר או 0.1 מ"ל בינוני לכל באר עבור 24 צלחות באר.
6. יש למרוח נפח מתאים של תרביות חיידקים מנורמלות (ראה סעיף 1) על החדר העליון של מערכת החדרת הממברנה החדירה. השתמש בתווך חיידקי לטיפולי בקרה לא נגועים. לקבלת התוצאות המתוארות כאן, הוסף 25 μl של התרביות המנורמלות לחדר עבור 24 צלחות באר ו 100 μl של התרביות לכל תא עבור 6 צלחות באר.
   הערה: במחקרים אלה, GAS מסוג בר או מוטנטי יושם על תאים מארחים ב MOI של 10. MOI חושב על סמך מספרי התאים האיקריוטים הסופיים (למשל 2 x 10⁶ תאים / באר), כך שנוספו פי 10 חיידקים לכל תא מארח בתחילת תקופת ההדבקה (למשל 2 x 10⁷ CFU לכל באר). MOI מתאים ישתנה עם מיני חיידקים שונים ועם ניתוחי המעקב הרצויים.
   הערה: בנוסף לשימוש בתווך חיידקי לבקרות לא נגועות, בקרות שימושיות אחרות עבור יישומים מסוימים של טכניקה זו עשויות לכלול חיידקים שהומתו בחום או מדיום חיידקי משומש להשוואה.
7. לדגור על תאים נגועים ב 37 ° C עם 5% CO₂.

4. אוסף דוגמאות

1. כדי לאסוף מדיום תרבית תאים, ליזטים של תאים מארחים, או כיסויי זכוכית עם תאים שלמים לניתוחי מעקב, התחל בהסרה זהירה של הקרום החדיר עם מלקחיים סטריליים.
2. להערכת חלבוני פונדקאי מופרשים:
   1. לאסוף את המדיום מן החדר התחתון לתוך צינורות 1.5 מ"ל. הימנע מלהפריע לשכבה האחידה במהלך האיסוף.
   2. דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 14,000 rcf למשך 10 דקות ב-4°C כדי להסיר פסולת תאית.
   3. יש להוציא את כל הסופרנאטנט למעט 50 מ"ל לשפופרת טרייה של 1.5 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20°C או להשתמש מיד.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מרק טוד-יואיט	אקומדיה	7161א	השתמש מרק מתאים עבור מיני חיידקים של עניין.
ביוספקטרומטר	אפנדורף	מודל בסיסי	כל ספקטרופוטומטר UV-Vis מתאים.
צלחות פטרי	פישר סיינטיפיק	FB0875713	מותגים אחרים מתאימים.
אגר	סיגמא	A1296-1 ק"ג	מותגים אחרים מתאימים.
HaCaT קרטינוציטים אפיתל אנושי			מתנת מעבדתו של ויקטור ניזט.
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	לייף טכנולוגיות	11995-073	השתמש במדיה מתאימה עבור קו עניין של תאים.
סרום בקר עוברי (FBS)	ביוווסט	S162H	השתמש בתוספי מדיה מתאימים עבור קו עניין של תאים.
כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ	אנונימי	150350	מותגים אחרים מתאימים.
6-באר תרבית רקמות מנות	CytoOne	CC7682-7506	מותגים אחרים מתאימים אך צריכים להיות תואמים לתוספת הקורנינג.
24 מנות תרבית רקמות באר	CytoOne	CC7682-7524	מותגים אחרים מתאימים אך צריכים להיות תואמים לתוספת הקורנינג.
כיסויי זכוכית	פישרברנד	12-541-ב	אלה חייבים להיות autoclaved לפני השימוש עבור ציפוי התא.
מלח חוצץ פוספט (PBS)	גיבקו	10010-023
פנול DMEM ללא אדום	לייף טכנולוגיות	31053028	מדיה ללא אדום פנול נדרשת רק עבור בדיקת שחרור LDH.
אלבומין בסרום בקר (BSA)	פישר סיינטיפיק	BP1600-100
ל-גלוטמין	גיבקו	25030149	נדרש רק כדי להשלים מדיה תרבית תאים עבור בדיקת שחרור LDH.
נתרן פירובט	גיבקו	BP356100	נדרש רק כדי להשלים מדיה תרבית תאים עבור בדיקת שחרור LDH.
תוספות Transwell בציפוי קולגן 0.4 מיקרון (6 באר)	קורנינג	3540
תוספות Transwell בציפוי קולגן 0.4 מיקרון (24 באר)	קורנינג	3595
מלקחיים	פישר	3120018	אלה חייבים להיות מעוקרים עם אתנול לפני הטיפול תוספות Transwell.
מגרדי תאים	פישרברנד	08-100-241	אלה נדרשים רק עבור אוסף של lysates התא.