חילוץ ליזט של תא מארח מתאים מארחים נגועים בתרבית במערכת ממברנות חדירה

תקציר

מקור: Flaherty, R. A., et al. יישום מערכת זיהום מבוססת ממברנה חדירה לחקר ההשפעות של רעלנים חיידקיים מופרשים על תאי מארח יונקים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים מערכת החדרת קרום חדירה כדי לחקור את ההשפעה של רעלנים חיידקיים על תאי המאכסן באופן מבוקר ומבודד. גישה זו מאפשרת חשיפה סלקטיבית של התאים לרעלים תוך שמירה על הפרדה פיזית המחקה את האינטראקציה הטבעית בין המאכסן לפתוגן.

פרוטוקול

1. תרבית חיידקים

1. יצירת זנים מוטנטיים איזוגניים שישמשו לחקר הגורם המופרש הספציפי.
   הערה: GASM1T1 5448 זני סטרפטוקוקוס ששימשו לניסויים אלה כללו WT GAS', מוטציה חסרהב-SLS של חתול sagAΔ (מקוצר בטקסט כ-ΔsagA), וזן משלים sagA (מקוצר בטקסט כ-ΔsagA+sagA).
2. הכינו במשך הלילה תרביות נוזליות של זני חיידקים מעניינים. יש לגדל זני גז M1T1 5448 ב-10 מ"ל של מרק טוד-יואיט בטמפרטורה של 37°C למשך 16-20 שעות לפני הדבקת תאים אנושיים.
3. צנטריפוגה לילה תרביות חיידקים (2,400 rcf למשך 10 דקות) והשעיה מחדש בתווך חיידקים טריים.
   הערה: מתלה באותו נפח שבו גדלו תרביות הלילה (5-10 מ"ל) מייצר בדרך כלל צפיפות אופטית התחלתית רצויה.
4. נרמל תרביות חיידקים לריכוזים התחלתיים שווים על ידי דילול התרביות המרחפים מחדש בתווך חיידקי נוסף עד לקבלת אותה צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD600) לכל הזנים שייבדקו (OD600 של כ- 1.0 מומלץ לנוחות).
   הערה: במחקרים אלה נעשה שימוש בתרביות חיידקים בשלב נייח כדי להדביק תאים מארחים מיד לאחר הנורמליזציה. עם זאת, מכיוון שזנים מסוימים של חיידקים יוצאים מהפאזה הנייחת באופן לא סינכרוני, ייתכן שיהיה מתאים יותר להתחיל זיהומים של המאכסן עם תרביות בשלב היומן אם נמצא שזה המקרה עבור הזנים המעניינים.
5. לפני ניתוח נוסף, בצע בדיקת ספירת מושבות כדי לקבוע את יחידות יצירת המושבה (CFU) למיליליטר הקיימות בתרביות ההתחלתיות, כך שניתן יהיה לקבוע את ריבוי הזיהום (MOI), או יחס החיידקים לתא מארח.
   1. הכינו דילול סדרתי של 1 מ"ל של תרביות חיידקים שנורמלו לצפיפות האופטית הרצויה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או במדיום גידול חיידקים מתאים (מרק טוד-יואיט שימש במחקרים אלה). הכינו דילולים הנעים בין ^10-1 ל-10-6 כדי לייצר לפחות סט אחד של צלחות אגר עם מושבות ניתנות לספירה, (30-300 מושבות). בצע את כל הדילולים בשלשה.
   2. מעבירים 100 μl מכל דילול סדרתי לצלחת אגר המכילה את התווך המתאים למיני החיידקים המנותחים.
      הערה: טוד-יואיט אגר שימש במחקרים אלה.
   3. השתמש במפזר חיידקים מזכוכית או פלסטיק כדי לפזר באופן שווה את 100 μl aliquot על פני כל פני השטח של צלחת האגר, ולהמשיך להתפשט עד שהנוזל נספג לתוך האגר. בצע תחת להבה בטכניקה סטרילית.
   4. דוגרים על צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד להופעת מושבות שניתן לספור.
   5. ספרו את המושבות שגדלות על כל צלחת וחשבו את ה-CFU/ml בתרבות המקורית לפי הנוסחה הבאה: מספר מושבות x הופכי לנפח הדילול/תרבית הטורי המצופה במיליליטרים.
      לדוגמה (200 מושבות x דילול 1/^10-5) / 0.1 מ"ל מצופה = 2.0 x 10⁸ CFU / מ"ל

2. תרבית תאים מארחת

1. השג קו תאים מארח מתאים עבור הניתוחים הרצויים.
   הערה: HaCaT אפיתל אנושי keratinocytes29, מתנה נדיבה מ V. Nizet, שימשו למחקרים אלה.
   1. שמרו על תאי HaCaT בצלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו עם 10% נסיוב בקר עוברי מומת בחום (FBS). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.

3. זיהום תאי מארח במערכת החדרת קרום חדירה

1. תאי צלחת בצלחות תרבית רקמה מתאימות ומאפשרים להם לגדול עד שהם מגיעים למפגש של 90%.
   הערה: תאי HaCaT המשמשים במחקרים אלה בדרך כלל מגיעים למפגש תוך 2-3 ימים לאחר הציפוי.
   1. עבור איסוף ליזט (למשל ניתוח איתות ובדיקות קביעת אדנוזין טריפוספט (ATP), צלחת תאי HaCaT ב 6 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 3 x 10⁵ תאים / באר.
   2. עבור ניסויי הדמיה אימונופלואורסצנטית, תאי צלחת על זכוכית סטרילית מכסים בתוך 6 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 3 x 10⁵ תאים / באר.
   3. עבור מבחני חדירות קרום אתידיום הומודימר ושחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH), צלחת תאי HaCaT ב -24 צלחות באר בצפיפות זריעה של כ 5 x 10⁴ תאים / באר.
2. מיד לפני הטיפול, לשטוף תאים עם PBS סטרילי 1x.
3. יש למרוח מדיום גידול טרי על תאים. עבור התנאים המתוארים כאן, להחיל 2 מ"ל בינוני לכל באר עבור 6 צלחות באר או 0.5 מ"ל בינוני לכל באר עבור 24 צלחות באר. אם נבדקים טיפולים תרופתיים, יש לערבב עם מדיום טרי ולמרוח במהלך שלב זה.
   הערה: בדיקות מסוימות עשויות לדרוש מדיה חלופית. לדוגמה, מכיוון שפנול אדום וריכוזים גבוהים בסרום מפריעים לבדיקת שחרור LDH, DMEM ללא פנול אדום בתוספת אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) (w/v), 2 מ"מ L-גלוטמין ונתרן פירובט 1 מ"מ שימש לניסויים אלה.
4. לאחר יישום מדיום טרי, מניחים בזהירות תוספת קרום סטרילית של 0.4 מיקרומטר חדירה בכל באר. בצע שלב זה במכסה מנוע זרימה למינרית, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הקרום החדיר לתוך כל באר.
5. יש למרוח מדיום תרבית תאים טרי על החדר העליון של כל באר בהתאם להוראות היצרן. עבור התנאים המתוארים כאן, להחיל 1 מ"ל בינוני לכל באר עבור 6 צלחות באר או 0.1 מ"ל בינוני לכל באר עבור 24 צלחות באר.
6. יש למרוח נפח מתאים של תרביות חיידקים מנורמלות (ראה סעיף 1) על החדר העליון של מערכת החדרת הממברנה החדירה. השתמש בתווך חיידקי לטיפולי בקרה לא נגועים. לקבלת התוצאות המתוארות כאן, הוסף 25 μl של התרביות המנורמלות לחדר עבור 24 צלחות באר ו 100 μl של התרביות לכל תא עבור 6 צלחות באר.
   הערה: במחקרים אלה, GAS מסוג בר או מוטנטי יושם על תאים מארחים ב MOI של 10. MOI חושב על סמך מספרי התאים האיקריוטים הסופיים (למשל 2 x 10⁶ תאים / באר), כך שנוספו פי 10 חיידקים לכל תא מארח בתחילת תקופת ההדבקה (למשל 2 x 10⁷ CFU לכל באר). MOI מתאים ישתנה עם מיני חיידקים שונים ועם ניתוחי המעקב הרצויים.
   הערה: בנוסף לשימוש בתווך חיידקי עבור בקרות לא נגועות, בקרות שימושיות אחרות עבור יישומים מסוימים של טכניקה זו עשויות לכלול חיידקים שהומתו בחום או מדיום חיידקי משומש לצורך השוואה.
7. לדגור על תאים נגועים ב 37 ° C עם 5% CO₂.

4. אוסף דוגמאות

1. כדי לאסוף מדיום תרבית תאים, ליזטים של תאים מארחים, או כיסויי זכוכית עם תאים שלמים לניתוחי מעקב, התחל בהסרה זהירה של הקרום החדיר עם מלקחיים סטריליים.
2. להערכה של ליזטים של תאים מארחים:
   1. שאפו בעדינות את התווך מעל השכבה החד-שכבתית של התאים המארחים. הימנע מלהפריע לשכבה החד-שכבתית, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן דגימה.
   2. יש לשטוף תאים פעם אחת עם PBS אחד.
   3. שאפו בעדינות PBS. יש למרוח מיד נפח מתאים של חיץ ליזה קר כקרח כדי להשיג את ריכוז החלבון הרצוי, ולדגור על הדגימות על קרח במשך 15 דקות. יש למרוח בין 200 μl ל-350 μl של חיץ ליזה לכל באר של כל צלחת בעלת 6 בארות כדי להשיג ריכוזי חלבון בין 0.5 ל-1.5 מ"ג/מ"ל
      הערה: מאגר הליזה ששימש במחקרים אלה הורכב ממים שעברו דה-יוניזציה, 1% (v/v) Nonidet P40 Substitute, קוקטייל מעכב פוספטאז וקוקטייל מעכב פרוטאז. ריאגנטים ספציפיים מפורטים בסעיף חומרים וציוד.
   4. השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים מפני השטח של הצלחת של כל באר ו pipette את כל התוכן של כל באר לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   5. דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 14,000 rcf למשך 20 דקות ב-4°C.
   6. כדי להעריך רכיבי ליזט מסיסים, הוציאו את הסופרנאטנט לצינורית חדשה ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C או השתמשו בו מיד.
   7. כדי להעריך רכיבים גרעיניים או רכיבים בלתי מסיסים אחרים של ליזט, שמרו את הגלולה ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20°C או השתמשו בה מיד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
HaCaT קרטינוציטים אפיתל אנושי			מתנת מעבדתו של ויקטור ניזט.
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	לייף טכנולוגיות	11995-073	השתמש במדיה מתאימה עבור קו עניין של תאים.
סרום בקר עוברי (FBS)	ביוווסט	S162H	השתמש בתוספי מדיה מתאימים עבור קו עניין של תאים.
כלי תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ	אנונימי	150350	מותגים אחרים מתאימים.
6-באר תרבית רקמות מנות	CytoOne	CC7682-7506	מותגים אחרים מתאימים אך צריכים להיות תואמים לתוספת הקורנינג.
תוספות Transwell בציפוי קולגן 0.4 מיקרומטר (6 בארות)	קורנינג	3540
מצופה קולגן 0.4 מיקרומטר תוספות Transwell (24 באר)	קורנינג	3595
מגרדי תאים	פישרברנד	08-100-241	אלה נדרשים רק עבור אוסף של lysates התא.
תחליף Nonidet P40	סיגמא	74385-1L	ספקים אחרים מתאימים.