זיהוי היצמדות חיידקים לתאים מארחים באמצעות דימות פלואורסצנטי

תקציר

מקור: Yang, J., et al. זיהוי אוטומטי בתפוקה גבוהה של היצמדות חיידקים לתאים מארחים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את בדיקת היצמדות החיידקים להערכת היצמדות חיידקים המתויגים ב-GFP לתרבית תאי אפיתל כדי לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות מארח-פתוגן באמצעות הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. היצמדות חיידקים וצביעת תאי המאכסן

1. ראשית, שטפו את חד-שכבות תאי A549 שלוש פעמים עם PBS 1x חם. עבור כל שטיפה, להוסיף 100 μL של 1x PBS לכל באר, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים, להיפטר 1x PBS או לחכות 10 s לאחר ההוספה, ולאחר מכן לשאוב כדי להסיר 1x PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של הקשר החיידקי, שכבו את התאים ב-100 מיקרוליטר של ריכוזים רצויים של תרחיף חיידקי עם MOI שונים (0, 1, 10 ו-100). סובב את החיידקים ב 200 x גרם במשך 10 דקות לדגור את תאי A549 נגועים ב 37 ° C, 5% CO₂ עבור 1 h.
   נוספים הערה: בניסוי זה, לכל תנאי היה שילוש טכני.
2. הסר את החיידקים שאינם קשורים על ידי שטיפת monolayers חמש פעמים עם חם 1x PBS כמתואר לעיל. הוסף 100 μL של 4% פורמלדהיד (ב 1x PBS) לכל באר של לוחות 96 באר כדי לתקן את התאים. הניחו לצלחות לשבת על קרח למשך 15 דקות ולאחר מכן שטפו את תמיסת הקיבוע באמצעות PBS 1x שלוש פעמים.
3. כדי להכתים את הגרעינים, הוסף 50 ng/mL של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ודגר אותו במשך 10 דקות ב- RT. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות שלוש פעמים באמצעות 1x PBS. כסו את תאי A549 הנגועים ב-100 μL של 1x PBS כדי למנוע התייבשות. מעבדים לשלב הבא או מאחסנים את הצלחת ב-4°C למשך עד יומיים בחושך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	תרמו פישר	62248	צבע צביעת תאי מארח
צלחת 96 באר	קורנינג	3882	חצי שטח טוב, תחתית שטוחה ושקופה
A549 תאים	ATCC	CCL 185	קו תאי יונקים
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R
OD600 DiluPhotometer	אימפלן
מרק סויה טיפוסי	תאי גידול	MBPE-4040
F-12k בינוני	ATCC	302004	מדיום תרבית תאים A549
סרום בקר עוברי	קורנינג	35-016-CV