טכניקת הדמיה לחקר תגובת הסידן בתאים נגועים בחיידקים

תקציר

מקור: Smail, Y., et al. הדמיה Ca²⁺ תגובות במהלך זיהום Shigella של תאי אפיתל. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי תגובה מקומית ועולמית של יוני סידן בעת זיהום שיגלה בתאי אפיתל אנושיים. שיגלה פולשת לתאים המארחים ומשחררת גורמי פלישה, המשפיעים על רמות הסידן התוך-תאי. המשרעת והתדירות של הסידן הציטוסולי המקומי והעולמי נחקרים באמצעות אינדיקטור פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. הכנות

1. הכנת חיידקים
   1. צלחת את החיידקים - זן בר Shigella המבטא את דבק AfaE (M90T-AfaE) - על צלחת אגר טריפטיקז סויה (TCS) המכילה 0.01% אדום קונגו (CR) ודגרה עליהם במשך 18 שעות ב 37 ° C.
      הערה: כדי להגדיל את יכולת השחזור שלהם, לוחות Shigella המתקבלים בשלב 1.1.1 מאוחסנים ב 4 ° C ויש להשתמש בהם בתוך שבוע מכיוון שכל המושבות על מדיום CR יהפכו בסופו של דבר לאדומות עם הזמן.
   2. חסן את מרק TCS לפני התרבית על ידי קטיף 3 מושבות אדומות מצלחות הפסים.
      הערה: חיסון עם 3 מושבות מבוצע כדי להגביל את ההסתברות לבחור שיבוט בודד שהפלסמיד האלים שלו עבר רקומבינציה גנטית.
   3. לגדל תרביות חיידקים נוזליות באינקובטור רועד במשך 16 שעות ב-37°C ב-200 סל"ד. מוסיפים אמפיצילין בריכוז סופי של 75 מ"ג/מ"ל. ריכוזי אנטיביוטיקה לא יעלו על פי 3 מהריכוז המעכב המינימלי, שכן עודף אנטיביוטיקה עלול להוביל לאובדן פלסמיד האלים הגדול.
      הערה: יש לאמת את תחזוקת פלסמיד האלימות של שיגלה על ידי ציפוי תרביות החיידקים על צלחות CR בתוספת ריכוזי אנטיביוטיקה מתאימים. נוכחותן של מושבות לבנות מצביעה על אובדן פלסמיד.
   4. יש לחסן את תרבית TCS בתרבית החיידקים בדילול של 1:100. לדגור אותו ב 37 ° C באינקובטור רועד במשך 2 שעות ב 200 סל"ד. ודא שהצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD_600nm) היא 0.2 - 0.4.
   5. צנטריפוגו את תרבית החיידקים למשך 2 דקות ב-13,000 x גרם ב-21°C והשהו מחדש את הגלולה בנפח שווה ערך של מדיום EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM גלוקוז ו-25 mM HEPES, pH = 7.3).
   6. דללו את המתלה החיידקי במאגר EM ב-OD_{סופי של 600nm} של 0.1 והשתמשו בו מיד או אחסנו אותו בטמפרטורה של 21°C והשתמשו בו תוך 60 הדקות הבאות.
2. הכנת תאים
   1. תרבית תאי HeLa ב- DMEM עם 1 גרם / ליטר של גלוקוז בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS) ולגדל אותם ב 37 ° C עם 10% CO₂. לגדל TC-7 גדל DMEM עם 4.5 גרם / ליטר של גלוקוז, המכיל 10% FCS וחומצות אמינו לא חיוניות באינקובטור 37 ° C המכיל 10% CO₂.
   2. לתחזוקת תאים, פצלו את התאים באופן קבוע כדי להימנע מעיכוב מגע גדילה הקשור למצבים מתמזגים; זה קריטי ליעילות גבוהה של טעינת בדיקה / טרנספקציה Ca²⁺.
   3. לוחית תאי HeLa על גבי כיסויים עגולים סטריליים בקוטר 25 מ"מ בלוחות 6 בארות בצפיפות של 3 x 10⁵ תאים / באר יום לפני הניסוי עבור תאי HeLa.
   4. עבור תאי TC-7, טריפסינזציה וספירת תאים. זרעו אותם ב 4 x 10⁵ תאים / באר ודגרו אותם במשך 5 - 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 10% CO₂ לפני הניסויים כדי לאפשר קיטוב.
      1. רעננו את מדיום תרבית התאים מדי יום עד ליום הניסוי.
         הערה: תאים חד פעמיים בקוטר 35 מ"מ בתחתית זכוכית עשויים לשמש גם כחלופה לבארות המכילות כיסויים. אם האחרונים משמשים, בקרת טמפרטורה באמצעות שלב מחומם או מטרה אינה מספיקה, ויש צורך בתא דגירה תרמוסטט המותקן על שלב המיקרוסקופ.
3. ביום הניסוי, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל EM בינוני ב 21 ° C.
4. טען את התאים עם 3 mM Fluo-4/אצטוקסימתיל אסטר (Fluo-4-AM) במאגר EM למשך 30 דקות ב 21 ° C.
   הערה: בעוד שההעמסה של תאי HeLa תת-חופפים אינה מעוררת בעיות משמעותיות, הטעינה של תאי TC-7 מקוטבים היא לעתים קרובות הטרוגנית ויעילה בצורה גרועה. עבור תאים אלה, מצאנו כי יעילות ההעמסה משופרת על ידי תוספת של חומר פיזור – חומצה פלורונית – בריכוז סופי של 0.1% ושל מעכב אניון-טרנספורטר ברומוסולפופטלאין בריכוז סופי של 20 מיקרומטר ל- EM המכיל Fluo-4-AM. השימוש בגשושיות כימיות יחסיומטריות או בבדיקות FRET מקודדות גנטית הדורשות רכישה כפולה אינו תואם את מהירות הרכישה הנדרשת להדמיית תגובות Ca²⁺ מקומיות.
5. שטפו את הדגימות 3x עם מאגר EM והמשיכו לדגור עליהן ב-1 מ"ל של חיץ EM ב-21°C כדי לאפשר הידרוליזה של ה-AM moiety. השתמש בתאים טעונים ב- Fluo-4 מיד או במהלך 90 הדקות הבאות (נשמר ב- 21 ° C).

2. זיהום ורכישת תמונה של תגובות מקומיות Ca²⁺

1. הניחו את הכיסוי המכיל את התאים הטעונים ב-Fluo-4 בתא הדמיה או בתא עם תחתית זכוכית. שטפו את הדגימות בתא ההדמיה או בתא חד פעמי עם תחתית זכוכית 3x עם מאגר EM כדי להסיר תרכובות שעלולות לנבוע מליזה של תאים. הוסף 1 מ"ל של מאגר EM.
2. הניחו את התא על במת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך שחומם בטמפרטורה של 33°C.
   הערה: טמפרטורה זו נבחרת כפשרה בין הטמפרטורות האופטימליות התואמות את תהליך הפלישה של שיגלה לבין האטת תגובות Ca²⁺ כדי להמחיש תגובות מקומיות. אנו משתמשים במטרת שמן טבילה 63X (NA = 1.25) המצוידת בטבעות ניגודיות פאזה.
3. בחר שדה מיקרוסקופיה והגדר פרמטרי רכישה, כולל זמן חשיפה ואיגוד במידת הצורך, כדי למטב את האות הפלואורסצנטי Fluo-4.
   הערה: האתגרים העיקריים של הדמיה מקומית Ca²⁺ הם המשרעת הנמוכה ומשך הזמן הקטן של התגובות, הדורשות רכישה לפחות כל 30 מילישניות. מספר התקנים מסחריים מסחריים להצמדת מטען מכפיל אלקטרונים (EM-CCD) או מצלמות מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת (C-MOS) מציגים את הרגישות הנדרשת כדי לזהות תגובות מקומיות של Ca²⁺ באמצעות Fluo-4. רגישות לגילוי היא גם נושא חשוב בהגבלת נזקי אור או ממצאים כגון תגובות ספונטניות הקשורות לעירור פלואורסצנטי של Fluo-4 בתדירות גבוהה. כאן, נעשה שימוש בתאורה מבוססת LED של 470 ננומטר, עם מסנן עירור פסים של 480 ± 40 ננומטר, מסנן דיכרואי של 505 ננומטר ופליטת פסים של 527 ± 30 ננומטר המשמשת ב-5% מהעוצמה המרבית שלה בשילוב עם מסנן צפיפות נייטרלית של 1.0 כדי למזער בעיות אלה תחת זרם של רכישות של משכי זמן מוגבלים. ניתוח של אותות Ca²+ מקומיים על ידי קבוצות של זרמים של 120 שניות בוצע באופן שגרתי. בתנאי תאורה נמוכים אלה, לא נצפתה הלבנה פלואורופורית במהלך רכישות הזרם של 2 דקות. ניתן לבצע רכישות עוקבות על אותו מדגם, בתנאי שנעשה שימוש בשדות שונים. ככלל, זרם רכישה ראשון מתבצע בשדה בקרה בהיעדר גירוי חיידקים כדי להבטיח היעדר תגובות ספונטניות. אם נצפות תגובות ספונטניות, הדגימות נשטפות עם מאגר EM עד שלא נצפות תגובות.
4. כדי להוסיף חיידקים לדגימה, הסר 500 μL של חיץ EM מהתא והוסף 500 μL של תרחיף החיידקים שהוכן בשלב 1.1.6 כדי לקבל OD_600nm סופי של 0.05, בזהירות המתאימה כדי למנוע הזזת שדה המיקרוסקופ שנבחר; הנפחים מבטיחים ערבוב נכון של החיידקים ופיזור הומוגני של החיידקים על דגימות התא.
5. בצע רכישה עם תוספת החיידקים. לחלופין, בצע רכישה 10 דקות לאחר תוספת החיידקים, אשר מתאים לזמן הדרוש לחיידקים לשקוע על תאים בתנאים המשמשים. בסוף זרם הרכישה, רכשו תמונת ניגודיות פאזה של השדה שנבחר כדי לדמיין את החיידקים הבאים במגע עם התאים ואת קפלי הממברנה הקשורים לאתרי פלישת חיידקים.
6. חזור על הליך הרכישה כמו בשלב 2.5, במרווחי זמן המקובלים על משך רכישת התמונות, שמירת הקבצים ובחירת שדה חדש שיכסה את התהליך כולו.
   הערה: עבור שיגלה, מצאנו כי זרמי רכישה כל 5 דקות במשך 20 דקות, לאחר שקיעת חיידקים של 10 דקות, אפשרו לכסות את רוב אירועי הפלישה.
7. בסוף הליך הרכישה, הוסף ריכוז סופי של 2 מיקרומטר של דגימות יונומיצין יונופור Ca²⁺ כדי לקבוע את המשרעת המקסימלית של אותות Ca²⁺. קבל תמונות כל 3 - 5 שניות עד לייצוב האות, בדרך כלל במשך פחות מ -10 דקות.
8. לאחר מכן הוסיפו Ca²⁺ chelator אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N, N, N′, N′-חומצה טטראצטית (EGTA) בריכוז סופי של 10 mM כדי לקבוע את האות הפלואורסצנטי בהיעדר Ca²⁺. קבל תמונות כל 3 - 5 שניות עד לייצוב האות, בדרך כלל למשך פחות מ- 10 דקות.
   הערה: בגלל הדינמיקה האיטית יחסית של וריאציות Ca²⁺ העולמיות, בצע רכישות אלה כל 3 - 5 שניות (לא במצב סטרימינג), מה שמאפשר הדמיה של Ca²⁺ על אותו שדה מיקרוסקופי במהלך הטיפולים הבאים.

3. ניתוח

1. בטאו וריאציות ציטוסוליות Ca²⁺ לאורך זמן כאחוז של ΔF/F0, כאשר ΔF מייצג את השונות של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של אזור העניין (ROI) ו-F0 את הפלואורסצנטיות הבסיסית באותו ROI, שאליו מופחת אזור לא רלוונטי בשדה נטול תאים.
   1. הסר את רמות הפלואורסצנטיות הבסיסיות עבור כל תא בשדות שונים, המתאימים לרמות הבסיס; רמות אלה ניתנות לקביעה חד משמעית בשל התדירות הנמוכה ומשך הזמן הקצר יחסית של תגובות Ca²⁺ מקומיות ברכישת זרם נתון.
      הערה: כמת תכונות בולטות של התשובות הקשורות לשאלות שנשאלו ולמודל הפתוגני שנחקר. באופן קלאסי, פרמטרים שונים נלקחים בחשבון כדי לנתח אותות Ca²⁺, כולל תדירות התאים המציגים תגובות Ca²⁺ מקומיות או גלובליות, כמו גם את משך, משרעת ותדירות של תגובות אלה. במקרה של שיגלה ותגובות מקומיות, היבט חשוב נוסף של הניתוח הוא הקשר המרחבי של התגובות עם אתרי פלישה חיידקיים.
2. כדי לכמת את אחוז התאים המגיבים המציגים תגובות כלליות או מקומיות, ציירו ROIs בתאים, בסדרות זמן המתאימות לווריאציות של עוצמת Fluo-4.
   1. הגדר פרמטרים מחמירים לזיהוי תגובות Ca²⁺ מקומיות, כגון משרעת של פי שלושה מעל וריאציות רקע של קו הבסיס הממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות, או משך זמן של לפחות 200 אלפיות השנייה, כדי להימנע מניקוד תוצאה חיובית מוטעית.
      הערה: ככלל, אפילו תגובות מקומיות קטנות של Ca²⁺ ניתן להבדיל מכל רעשי רקע לפי הפרופיל שלהם. החזר ההשקעה צריך להיות גדול מספיק כדי לשלב מספיק אותות פלואורסצנטיים כדי לאפשר זיהוי של וריאציות מקומיות. בהתאם לעוצמת זיהוי Fluo-4, ROI אלה עשויים להתאים למעגלים בקטרים הנעים בין 2 - 5 mM.
   2. מדוד את השונות של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של Fluo-4 בשני אזורים באזור נפרד של אותו תא, כדי לקבוע אם התגובות הן מקומיות או גלובליות.
      הערה: ניתוח של מספר רב של תאים מתאפשר על ידי שימוש בתוכנת הדמיה המאפשרת להציג מסך מקוון של וריאציות של עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאורך זמן עבור האזורים שנבחרו. לתוכנת הדמיה מסחרית יש אפשרות כזו, אך ניתן לבצע זאת גם באמצעות התוכנה החינמית Icy, באמצעות תוסף ROI Intensity Evolution.
   3. קביעת אחוז התאים המציגים תגובות מקומיות.
      הערה: אחוז זה מחושב מתוך המספר הכולל של תאים שנותחו בשדה המיקרוסקופ, אשר צריך להיות במספרים מספיקים כדי לתמוך מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן לא פרמטרי.
   4. קבע את משך הזמן של התגובות המקומיות.
      הערה: ניתן להבדיל עוד יותר בין תגובות Ca²⁺ מקומיות על פי טווחי משך הזמן שלהן (כלומר, פחות מ-500 מילישניות, בין 5 ל-10 שניות, או מעל 10 שניות) והקשר שלהן לאתרי הפלישה של שיגלה.
3. כמת את המשרעת של התגובות. תחילה, כייל את רמות Ca²⁺ המרביות ואת רמות הרקע של התא שנקבעו בשלב 2.1.7. מכיוון שעומס Fluo-4 עשוי להשתנות עבור כל תא, בצע קביעות אלה עבור תאים בודדים בשדה.
   1. בטא את המשרעת של התגובות כאחוז יחסי מהתגובה המקסימלית.
   2. בצע בדיקה סטטיסטית באמצעות מבחן נורמליות, ואחריו מבחן פרמטרי כדי לנתח הבדלים פוטנציאליים באמפליטודה של תגובות בין דגימות.
   3. קבע את הקשר של תגובות אלה ביחס לאתרי הפלישה החיידקיים על ידי לוקליזציה שלהם בהתאמה לקפלים של קרום המושרה על ידי חיידקים המוצגים בתמונות ניגודיות הפאזה המתאימות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph גרסה 7.7	הדמיה אוניברסלית
מערכת תאורת CoolLED pE-2	רופר סיינטיפיק
צלחת מיקרו 35 מ"מ, גבוהה	איבידי	81156
ציר סויה טריפטיקז (TCS)	תרמופישר	B11768
אגר TCS	תרמופישר	B11043
קונגו אדומה	סיגמא-אולדריץ'	75768
M90T-AfaE	סאן ואח' 2017		Shigella flexneri serotype V. המבטא את דבק AfaE
ipgD-AfaE	סאן ואח' 2017		זן מוטנטי איזוגני ipgD המבטא את דבק AfaE