ניתוח סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ותאי ראג'י טעונים SEB באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

תקציר

מקור: Wabnitz, G. et al., ניתוח איכותי וכמותי של סינפסת החיסון במערכת האנושית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מנתח את היווצרות הסינפסה החיסונית בין תאי T בתכשירי פאן-לויקוציטים לא מטוהרים לבין Staphylococcus aureus enterotoxin B, תאי ראג'י טעוני SEB. העשרת CD3 ו- F-actin נצפית בסינפסה החיסונית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פאן לויקוציטים

1. לשאוב 1 מ"ל של דם היקפי מתורם בריא (או חולה) מזרק heparinized. יש לוודא קבלת אישור מוועדת האתיקה האחראית לתרומת הדם.
2. יש לערבב 1 מ"ל של דם היקפי אנושי עם 30 מ"ל של מאגר ליזיס ACK (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃ ו- 0.1 mM EDTA, pH 7.0) בצינור של 50 מ"ל ולדגור במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מלאו את הצינורות ב-PBS ובצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 6 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-30 מ"ל של חיץ ליזיס ACK.
4. חזור על שלבים 1.2 ו-1.3 עד שהסופרנאטנט נקי. לבסוף, לשטוף את התאים PBS, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 2 מ"ל של מדיום תרבית (RPMI1640 + 10% FCS). לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 60 דקות.

2. טעינת תאי ראג'י עם SEB

1. הכינו שני צינורות פלקון 15 מ"ל עם 1.5 x 10⁶ תאי ראג'י לכל צינור. סובבו את התאים (300 x גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר) והשליכו את הסופרנאטנט.
2. מרחפים מחדש את התאים בתווך שיורי (כ-50-100 מיקרוליטר), מוסיפים SEB של 1.9 מיקרוליטר (1.9 מיקרוגרם) ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום תרבית, מסובבים את התאים (300 x גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר), ומרחפים מחדש את הגלולה בתווך תרבית (RPMI1640 + 10% FCS) בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל.

3. השראת סינפסות חיסוניות ופרוטוקול צביעה

1. פיפטה 500 μL של הכנת תאי Raji טעונים SEB לתוך צינור FACS ו 500 μL של הכנת תאי Raji פרוקים לתוך צינור FACS אחר. הוסף 650 μL של pan-leukocytes לכל צינור ולסובב את התאים (300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר). השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של מדיום תרבית (RPMI1640 + 10% FCS). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C (בדרך כלל למשך 45 דקות).
2. מערבלים בעדינות את התאים (10 שניות ב-1,000 סל"ד) ומוסיפים 1.5 מ"ל של פרפורמלדהיד (1.5%) במהלך המערבולת כדי לתקן את התאים. עצור את הקיבוע על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA. גלולה את התאים (300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואת ההשעיה גלולת התא ב 1 מ"ל של PBS + 1% BSA לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
3. גלולה (300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר) ולהשהות מחדש את התאים ב 100 μL של PBS + 1% BSA + 0.1% saponin במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחדור את התאים (צלחת 96 באר, בצורת U).
4. לשטוף את התאים PBS + 1% BSA + 0.1% saponin עם צנטריפוגה (300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר) ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 50 μL של PBS + 1% BSA + 0.1% saponin המכיל נוגדנים או תרכובות עם תווית פלואורופור (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150), ו- DAPI (1:3,000)).
5. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות. לשטוף את התאים 3 פעמים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA + 0.1% saponin. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים ב- 60 μL של PBS לצורך ציטומטריית זרימת הדמיה.

4. רכישת תמונה באמצעות ציטומטר זרימה

הערה: הליך רכישת התמונות וניתוח הנתונים הבאים מבוססים על ציטומטריית זרימת הדמיה באמצעות תוכנות כגון imagestream (IS100), INSPIRE ו- IDEAS. עם זאת, ניתן להשתמש גם בציטומטרים אחרים של זרימה ובתוכנות ניתוח.

1. פתח את תוכנת הניתוח במחשב המחוברת לציטומטר זרימת ההדמיה ולחץ על Initialize Fluidics בתפריט המכשיר. החל את החרוזים על היציאה הימנית כאשר תתבקש לעשות זאת.
2. טען את תבנית ברירת המחדל מתפריט קובץ ולחץ על הפעלה/הגדרה. בחר חרוזים מהתפריט הנפתח תצוגה.
3. התאם את תאורת השדה הבהיר על-ידי לחיצה על הגדר עוצמה אם הערך שצוין נמוך מ- 200.
4. הפעל את שגרת הכיול והבדיקות בכרטיסיה סיוע על-ידי לחיצה על התחל הכל.
5. לחץ על Flush/Lock/Load והחל את הדגימות ביציאה השמאלית כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר טעינת התאים בציטומטר הזרימה, פתח את מסווג התאים והתאם את הערכים באופן הבא: גבול עליון של עוצמת שיא ב- 1,022 עבור כל ערוץ, גבול תחתון של עוצמת שיא ב- 50 עבור ערוץ 2 (DAPI) וערוץ 5 (CD3-Pe-TxR), אזור גבול תחתון ב- 50 עבור ערוץ 1 (פיזור צדדי) וגבול עליון ב- 1,500.
6. שנה את עוצמת לייזר העירור ל- 405 ננומטר (15 mW), 488 ננומטר (200 mW) ו- 647 ננומטר (90 mW) בכרטיסיה התקנה.
7. העבר את התפריט הנפתח תצוגה בין תאים וחרוזים כדי להעריך את מסווג התאים ואת התאמות עוצמת הלייזר.
   הערה: ודא שכל התאים וזוגות התאים נמצאים בתצוגת התא ושגושי תאים, פסולת ותמונות עם פיקסלים רוויים נמצאים בתצוגת הפסולת על-ידי שינוי מסווגי התאים ו/או כוחות לייזר העירור.
8. הגדר את שם המדגם ואת מספר התמונות שיש לרכוש (15,000-25,000 עבור דגימות ו- 500 עבור בקרות פיצוי) בכרטיסיה הגדרה. לחץ על הפעלה/הגדרה כדי להתחיל ברכישה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Multifuge 3 SR	הראיוס
RPMI 1640	לייף טכנולוגיות	#11875085	500 מ"ל
FCS	פאן ביוטק #3302-P101102
צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה	בז	#352054	5 מ"ל
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	סיגמא	D8662
אלבומין בסרום בקר	רוט	#8076.3
ספונין	סיגמא	S7900
פרפורמאלדהיד	סיגמא אולדריץ'	#16005
ספיד בירוז	אמניס	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
צלחת מיקרוטיטר	גריינר ביו וואן	#650101	96U
אנטרוטוקסין SEB	סיגמא אולדריץ'	S4881
דאפי	סיגמא אולדריץ'	D9542	יחס אחד עד שלושת אלפים
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	יחס אחד לשלושים
פאלואדין-AF647	בדיקות מולקולריות	A22287	יחס אחד לחמישים
IS100	אמניס		ציטומטר זרימה הדמיה
רעיונות	אמניס		תוכנה
השראה	אמניס		תוכנה