בדיקה לחקר הרגולציה של פגוציטוזה מקרופאגים על ידי תאי גזע מזנכימליים

תקציר

מקור: Evans, J. F., et al. ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאגים פגוציטוזה; כימות והדמיה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ויסות תאי גזע מזנכימליים (MSC) של מקרופאגים פגוציטוזה בתרבית משותפת. לאחר תרבית משותפת של MSC עם מקרופאגים, חלקיקים זימוזניים לא אופסוניים מצומדים לפלואורופור הרגיש ל- pH מתווספים לפאגוציטוזה על ידי המקרופאגים. עם העלייה בפאגוציטוזה, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה, ומאפשרת לקבוע רגולציה בתיווך MSC של פעילות פגוציטית.

פרוטוקול

הערה: כל טכניקות ההכנה הבינונית ותרבית התאים מתבצעות בתנאים אספטיים באמצעות ארון בטיחות ביולוגית עם זרימה למינרית. כל שלבי הדגירה המתוארים מתבצעים באמצעות אינקובטור שנועד לשמור על אטמוספירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.

1. תרבית תאים

1. הכנת מדיום צמיחה
   1. עבור MSC (תאי גזע מזנכימליים) ו- LADMAC (מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר; הוא נגזר משמות החוקרים שהקימו את קו התאים: Laskin, Dower ו- Malech), הוסף 50 מ"ל של FBS ו- 5 מ"ל של תערובת אנטיביוטית / אנטימיקוטית 100x ל- 500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco).
   2. עבור המקרופאגים (MΦ), הוסף 50 מ"ל של FBS, 100 מ"ל של מצב LADMAC בינוני (מוכן בעקבות השלבים של סעיף 1.2), ו 5 מ"ל של תערובת אנטיביוטיקה 100x ל 500 מ"ל של גלוקוז גבוה DMEM.
      הערה: תאי LADMAC מייצרים גורם מגרה מושבה (CSF-1) הדרוש לתמיכה בצמיחת תאי MΦ.
2. להפיץ תאים כהכנה לתרבית משותפת
   1. כדי לזרוע תאי MSC ו-MΦ מהמלאי הקפוא, יש לאזן 9 מ"ל של מדיום גידול מתאים שהוכן בסעיף 1.1 בכל אחת מארבע תרביות התאים בקוטר 100 מ"מ לכל סוג תא ולהניח באינקובטור תרביות התאים למשך 15 דקות.
   2. בינתיים, במהירות להפשיר את aliquots של 10⁶ תאים קפואים על ידי דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות או עד רק הפשרה. לאחר מכן, הוסף את תאי MSC המופשרים ל- 9 מ"ל של מדיום גידול MSC טרי והוסף את תאי ה- MΦ המופשרים ל- 9 מ"ל של מדיום גידול MΦ טרי בצינורות חרוטיים סטריליים של 15 או 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 125 x גרם ברוטור דלי מתנדנד למשך 5 דקות.
   3. יש לשאוף או לרוקן את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה ב-4 מ"ל של מצע הגידול הטרי המתאים על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לכל אחת מארבע צלחות 100 מ"מ עבור כל סוג תא ששוקלו בשלב 1.2.1.
   4. מחזירים את הכלים עם התאים לאינקובטור. החליפו את המדיום כל 2-3 ימים עד למפגש של 70%-80%.

2. זרע MSC בצלחות ניסיוניות, יום 1

הערה: לפני זריעת MSC, תכנן את פריסת הלוחות הניסיונית של 96 בארות עבור ספקטרופוטומטריה פלואורסצנטית ואת שקופית התא עבור הדמיה דינמית. עבור צלחת 96 בארות, לאגף בארות ניסיוני עם בארות המכילות תאים אבל לא להשתמש בהם בבדיקה. סמן לפחות ארבע בארות שישמשו לריאגנט ריק (RBL). ראה טבלה 1 לדוגמה תבנית של 96 בארות וטבלה 2 לדוגמה של תבנית שקופית קאמרית בת 4 בארות. מומלץ להשתמש בצלחות שחורות או לבנות בעלות 96 בארות עם תחתית שקופה. שקופית תא זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ היא אופטימלית, אך ניתן להתאים את מספר התאים בהתאם לעיצוב המחקר. תרשים זרימה מסכם של השיטות הבאות כלול באיור 1.

1. במפגש של 70%-80%, יש לשאוף את מדיום הגידול מהתרביות בצלחות של 100 מ"מ ולהוסיף 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לבודד את MSC.
2. שאפו את PBS, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית), והניחו אותו באינקובטור התרבית למשך 3-5 דקות.
3. לאחר 3 דקות, בדוק את ניתוק התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מנותקים, המשך לשלב הבא; אם לא, ממשיכים לדגור עוד 1-2 דקות. אין לדגור יותר מ-5-6 דקות.
4. מוסיפים 5 מ"ל של מצע גידול טרי לצלחת עם התאים המנותקים. שוטפים את הכלי בתערובת טריפסין/מדיום ואוספים תאים לצינור חרוטי נקי וסטרילי בנפח 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית.
5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 125 x גרם. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-10 מ"ל של מדיום גידול טרי על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה.
6. כדי לספור את התאים, הוסף 10 μL של תרחיף התא ל 30 μL של 0.4% תמיסת טריפאן כחול בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. לאחר מכן, פיפטה 10 μL של התערובת מתחת לכיסוי של תא ספירת hemocytometer.
7. באמצעות מיקרוסקופ שדה הפוך או בהיר, עם המטרה 10x, לספור את התאים הלא מוכתמים (קיימא) בארבעה מתוך 1 מ"מ² ריבועים. חשב את מספר התא באמצעות הנוסחה: תאים/מ"ל = ספירת תאים/# 1 מ"מ² ריבועים x מקדם דילול x 10⁴.
   הערה: בדוגמה זו, מספר 1 מ"מ² ריבועים שנספרו הוא ארבעה, ומקדם הדילול הוא 4.
8. השתמש במשוואה C₁V₁ = C₂V₂ כדי לחשב ולהכין השעיה של 1 x 10⁵ תאים/מ"ל. הכינו 1 מ"ל של תרחיף תא/מ"ל לכל עמוד של צלחת 96 הקידוחים שיש למלא ו-0.75 מ"ל לכל תא של שקופית תא 4 בארות שיש למלא בהתאם לעיצוב הצלחת.
   הערה: C₁ = ספירת תאים, V₁ = מה מחושב, C₂ = 1 x 10⁵, V₂ = 5.50 מ"ל.
9. קבע V₁, והחסר אותו מ 5.50 מ"ל הרצוי של נפח הכולל כדי לקבוע את נפח המדיום הטרי הדרוש להכנת ההשעיה. הוסף את נפח התאים (V₁) מהמתלה המקורי לנפח המדיום הטרי לקבלת סך כולל של 5.50 מ"ל עם 1 x 10⁵ תאים/מ"ל.
10. הוסף 100 μL של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל מתלה לכל באר של צלחת 96 בארות בהתאם לעיצוב הצלחת באמצעות מיקרו פיפטור רב ערוצי ו 530 μL לכל בארות של שקופית התא באמצעות מיקרופיפטה בהתאם לעיצוב הצלחת. לדגור לילה.
    הערה: עבור ניסוי זה, MSCs מצופים בעמודות 1, 2, 3 ו-6 של לוח 96 בארות (טבלה 1) ובארות 1 ו-2 של שקופית תא 4 בארות (טבלה 2). לכן, לפחות 5.50 מ"ל של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל מתלה מוכן. MΦ במפגש של 80% מטופל במתווכי דלקת באותו יום שבו נזרעים MSCs בצלחות הניסוי.

3. בודדו את ה-MΦ והכינו את התרבויות, יום 2

1. הסר את מדיום ההפעלה מתאי MΦ והחלף אותו ב- 5 מ"ל של מדיום גידול טרי. מגרדים בעדינות עם מרים תאים ואוספים את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
2. ספור את התאים באמצעות הדרה כחולה טריפאן והמוציטומטריה כמתואר עבור MSC ב, שלבים 2.6-2.7.
3. בעזרת המשוואה בשלבים 2.8-2.9, הכינו שני תרחיפים נפרדים של 2 x 10⁵ תאים/מ"ל, אחד עם תאים מהביקורת ואחד עם תאים מתרביות MΦ שטופלו.
   הערה: הכינו 1 מ"ל של תרחיף תא/מ"ל עבור כל עמוד של צלחת 96 בארות שיש למלא ו-0.75 מ"ל עבור כל תא של שקופית תא 4 בארות שיש למלא בהתאם לעיצוב הצלחת.
4. שאפו בעדינות את התווך מבארות הניסוי של צלחת 96 בארות המכילה MSC. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, הוסף 100 μL של מתלי תאי MΦ מטופלים ובקרה בבארות הניסוי המתאימות עם ובלי MSC בהתאם לתכנון הצלחת. לדגור למשך הלילה.
5. שאפו בעדינות את המדיום משקופית התא 4 בארות המכילה MSC, ובאמצעות מיקרופיפטה, הוסיפו 530 μL של תרחיף תאי MΦ לבארות המתאימות בהתאם לתכנון. לדגור למשך הלילה.

4. בדיקת פגוציטוזיס, לוח פלואורסצנטי קינטי 96-באר לקרוא, יום 3

1. הגדרת פרמטרי הבדיקה
   1. ביום הבדיקה, הפעל את קורא הלוחות הפלואורסצנטי והגדר במחשב את הטמפרטורה במערכת ל -37 מעלות צלזיוס.
   2. פתח את תוכנת System Pro ובדוק את סמל ההתקן בפינה השמאלית העליונה כדי לקבוע אם ההתקן מחובר למחשב. אם העיגול האדום עם הקו גלוי, לחץ על סמל המכשיר ובחר את המכשיר בחלון המוקפץ כדי לבצע את החיבור.
   3. בחר New Experiment כדי לגשת לחלון הקופצני Plate Set-Up Helper. בתפריט Plate Set-Up Helper, בחר Configure Your Acquisition Settings.
   4. בחר Monochromator מתפריט ההגדרות עבור התצורה האופטית. בחר FL (fluorescence) עבור מצב הקריאה ו- Kinetic עבור סוג הקריאה.
   5. באותו חלון תצורות, תחת קטגוריה, לחץ על אורכי גל ולאחר מכן הגדר רוחב פס ל- 9 ננומטר לעירור ו- 15 ננומטר לפליטה.
   6. הגדר את מספר זוגות אורכי הגל ל- 1. הגדר את אורכי הגל LM1 ל- 510 ננומטר לעירור ול- 540 ננומטר לפליטה.
   7. המשך בין הקטגוריות ובחר סוג צלחת הבא. בחר באפשרות המתאימה לסוג הצלחת שבשימוש.
      הערה: חשוב שהבחירה תתאים לסוג הצלחת. גבהי הקריאה נקבעים על ידי המערכת בהתאם לבחירה.
   8. לאחר מכן, בחר אזור קריאה וסמן את השטח של צלחת 96 בארות הכלולה בעיצוב הניסוי.
   9. בחר PMT ואופטיקה, הגדר את רווח PMT לגבוה ואת הבזקים לכל קריאה ל- 6. סמן את התיבה לצד קרא מלמטה אם אתה משתמש בלוח תחתון שקוף.
   10. בחר תזמון והגדר למרווחי זמן של 10 דקות על פני פרק זמן של 70 דקות.
   11. בחר טלטול, סמן את התיבה לפני קריאה ראשונה והגדר אותה למשך 5 שניות. סמן את התיבה בין קריאות והגדר אותה למשך 3 שניות. הגדירו את עוצמת הניעור הן לנמוכה והן ליניארית.
   12. סגור את החלון. כאשר החלון Plate Set-Up Helper מופיע, בחר הגדר את פריסת הצלחת שלך. הדגש את בארות BL של עיצוב הצלחת ולחץ על Plate Blank.
   13. סמן כל אחת משורות הניסוי, לחץ על הוסף, תן שם לקבוצה ולאחר מכן בחר צבע.
   14. תחת אפשרויות הקצאה מתחת לעיצוב הלוח, בחר סידרה ולאחר מכן הגדר את הסידרה בחלון ולחץ על אישור. חזור על הפעולה עבור כל קבוצה.
2. הכינו את ההשעיה הזימוזנית
   1. בזמן ההמתנה לטמפרטורת המערכת להגיע ל -37 מעלות צלזיוס, השהה מחדש 1 מ"ג של חלקיקי זימוזן ב -5 מ"ל של מדיום הדמיה של תאים חיים.
      1. הוסף 1 מ"ל של מדיום הדמיה של תאים חיים לבקבוקון המכיל את החלקיקים ואסוף אותם לתוך צינור תרבית זכוכית. שטפו את הבקבוקון עם 1 מ"ל נוספים של תמיסת הדמיה והעבירו אותו לאותו צינור זכוכית כדי לוודא שכל החלקיקים מועברים. הוסף 3 מ"ל של תמיסת הדמיה נוספת כדי להשיג 0.2 מ"ג / מ"ל של תרחיף חלקיקים.
   2. מערבולת עם פולסים מהירים במשך 30-60 שניות. לאחר מכן, השתמש בסוניקטור בדיקה כדי לבצע סוניקציה עם 60 פולסים מהירים.
      הערה: חשוב מאוד ליצור תרחיף הומוגני של חלקיקים ולא לתת לתרחיף לשבת זמן רב מדי לפני הוספה לבארות הניסוי. התגבשות חוזרת במהירות. ייתכן שיהיה צורך למטב את החלקיק לכל צפיפות תא בהתאם למקור, לטיפול ולצפיפות של MΦ בשימוש. במחקרים שהוצגו נעשה שימוש בחלקיקי זימוזן מצומדים. עם זאת, E. coli מצומד ו S. aureus זמינים גם.
3. מוסיפים זימוסן וקוראים את הצלחת
   1. שאפו את התווך מבארות הניסוי ושטפו 1x עם 100 μL של תמיסת הדמיה של תאים חיים. שטפו גם את בארות RBL בתמיסת הדמיה של תאים חיים.
   2. שאפו את תמיסת ההדמיה של תאים חיים מבארות ניסיוניות ובארות RBL והחליפו אותה ב-100 μL של השעיית חלקיקי הזימוזן.
   3. פתח את מגש הלוחות של קורא הפלואורסצנט באמצעות ממשק לוח המגע. הניחו את הצלחת, ללא המכסה, במגש עם באר A1 בפינה השמאלית העליונה. סגור את המגש באמצעות לוח המגע ולחץ על כפתור הקריאה הירוק בתפריט העליון.
   4. לאחר השלמת הקריאה, שמור את הקובץ בתיקייה המתאימה וייצא את הנתונים בפורמט גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על קובץ ובחירה באפשרות יצא.
   5. חשב את הפלואורסצנטיות היחסית ± SEM הממוצעת עבור כל קבוצת שכפול בכל נקודת זמן (10 דקות, 20 דקות, 30 דקות וכו') בגיליון האלקטרוני (קובץ משלים 1) והעבר את הנתונים לתוכנת גרפים.
   6. השתמש בתבנית גרף קווי כדי להציג את הנתונים ולהחיל ANOVA דו-כיווני (Time x Treatment/MSC כגורמים) ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות בודדות.
      הערה: בזמן שקריאת הלוח בת 96 הבארות מתבצעת, הכינו את לוח ההדמיה הדינמי לרכישת תמונה בהילוך מהיר. ודא שההדמיה הדינמית מתקדמת עם ניתוח של באר ניסוי אחת בכל פעם.

טבלה 1: דוגמה לעיצוב צלחת של 96 בארות. CBL - תא ריק; MSC - יום זרע 1; MΦ+ מטופל ו- MΦ זרע לא מטופל יום 2; מגיב RBL ריק נוסף ביום הבדיקה 3.

	1	2	3	4	5	6	7
א	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ב	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ג	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ד	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ה	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ו	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ז	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
ח	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL

טבלה 2: דוגמה לעיצוב שקופית קאמרית בעלת 4 בארות. MSC - מצופה יום 1; MΦ+ מטופל ו- MΦ לא מטופל מצופה יום 2.

1	2	3	4
MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה של תרבית משותפת ובדיקת פאגוציטוזה. מתווה של זרימת העבודה לניתוח כמותי ואיכותי של פעילות פגוציטוזה MΦ בתרבות משותפת עם MSC.

קובץ משלים 1: קובץ גיליון אלקטרוני מייצג של נתונים קינטיים גולמיים מניסוי אופטימלי. אנא לחץ כאן להור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96-באר פוליסטירן שחור Microplate	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0.4% תמיסה כחולה טריפאן	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 מ"ל ו 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן סטריליות חרוטיות	תרמופישר	339653
גיבקו אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (100X)	תרמופישר	15240096
מרים תאים	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
צלוחיות תרבית, טיפול בתרבית רקמות, שטח פנים 75 סמ"ר, צוואר משומר, עם כובע, מסונן	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	עכבר קו תא MSC
DMEM, גלוקוז גבוה	תרמופישר	11965092
סרום בקר עוברי, מוסמך, מומת חום	תרמופישר	16140071
המוציטומטר	פישר סיינטיפיק	02-671-51ב
I-11.15	ATCC	CRL-2470	עכבר קו תא MΦ
קו תא LADMAC	ATCC	CRL-2420	תאי LADMAC מפרישים את גורם הגדילה גורם מגרה מושבה 1 (CSF-1).
פתרון הדמיה של תאים חיים	תרמופישר	A14291DJ
PBS, pH 7.4	תרמופישר	10010031
pH רודו ירוק זימוזן ביוחלקיקים מצומדים	תרמופישר	P35365
ספקטרמקס i3X	התקנים מולקולריים
יחידות מסנן ואקום סטריליות לשימוש חד פעמי, 250 מ"ל, 0.2 מיקרומטר	תרמופישר	568-0020
מסנני מזרק סטריליים, 0.2 מיקרומטר	תרמופישר	723-2520
כלי תרבית שטופלו בתרבית רקמות, 100X20 מ"מ	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום	תרמופישר	25300054