החדרת חלבוני השפעה חיידקיים לתאי יונקים על ידי אלקטרופורציה

תקציר

מקור: Sontag, R. L. et al., אלקטרופורציה של חיידקים פונקציונליים לתוך תאי יונקים. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים החדרה של חלבוני השפעה חיידקיים לתאי יונקים באמצעות אלקטרופורציה. הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני האפקט החיידקי מזוהה במיקרוסקופ קונפוקלי לאחר צביעה בנוגדנים מצומדים פלואורופורים ספציפיים.

פרוטוקול

1. אלקטרופורציה

1. מניחים 400 מיקרוליטר של תרחיף תאים בקובטה מקוררת מראש ומוסיפים 20 מיקרוגרם של חלבון נבחר לקובט (50 מיקרוגרם / מ"ל).
2. החלק את הקובטה בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב מבלי לפגוע בתאים. הערה: ניתן גם להפוך את הקובט מספר פעמים כדי לערבב היטב, אך אין לשפשף למעלה ולמטה או מערבולות כדי למנוע פגיעה בתאים.
3. יבש את החלק החיצוני של הקובטה עם מגבת נייר או מגב אחר כדי למנוע קשת חשמלית באלקטרופורטור.
4. דגימת אלקטרופורטים ב 0.3 kV עבור 1.5-1.7 mssec. הערה: זה היה אופייני למחקר זה.
5. מיד לאחר ההתחשמלות, העבירו את הקובט בעדינות ~10 פעמים כדי לערבב היטב.

2. ציפוי תאים

1. אחסנו את הקובטה עם תאים מחושמלים על קרח עד שהיא מוכנה להצבה בצלחות התאוששות.
2. עבור רוב הניתוחים במורד הזרם, שטפו את התאים פי 1 עם גז טבעי טבעי שחומם מראש כדי להסיר חלבון אפקט חיצוני.
   1. הסר תאים לניתוח והשהה ב- 3-5 מ"ל של גז טבעי טבעי.
   2. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 900 x גרם במשך 4 דקות.
   3. יש להשהות מחדש בנפח מתאים של גז טבעי נוזלי לגודל הצלחת הרצוי (למשל, 2 מ"ל לצלחת של 35 מ"מ).
3. הסר את כמות התאים המתאימה לניתוח במורד הזרם.
   1. דוגמה 1: צלחת לתוך צלחת לתוך צלחת תחתית זכוכית לניתוח מיקרוסקופיה.
   2. דוגמה 2: צלחת לתוך פלסטיק תרבית תאים עבור ניתוח חלבונים כגון טיהור אהדה.
4. אפשרו לתאים להתאושש בלוחות שווי משקל באטמוספירה לחה של 95% אוויר/5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.

3. ניתוח מיקרוסקופיה

1. קיבוע/צביעת אימונופלואורסנציה
   1. יש לשטוף תאים פעם אחת עם PBS סטרילי לאחר תקופת התאוששות של 4 שעות.
   2. תקן תאים ב 100% מתנול במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. השתמשו בכמות מספקת של מתנול כדי לכסות לחלוטין את התאים (למשל 2 מ"ל עבור צלחת של 35 מ"מ).
   3. יש לשטוף 3x עם PBS סטרילי.
   4. חדיר תאים עם 0.4% Triton X-100 ב- PBS למשך 15 דקות. לדוגמה, השתמש 1 מ"ל עבור צלחת בקוטר 35 מ"מ.
      1. התאימו את אורך החדירות והחוזק של Triton X-100 בהתאם לאפיטופ ולמיקום של חלבון המטרה. הערה: התוצאות הטובות ביותר יצטרכו להיקבע אמפירית עבור כל מטרה, עם זאת, התנאים לעיל צריכים להיות מספיקים עבור רוב המטרות הציטוסוליות.
   5. חסום עם אלבומין סרום בקר 5% (BSA) ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT. לדוגמה, השתמש 1 מ"ל עבור צלחת בקוטר 35 מ"מ.
   6. יש לשטוף 3x עם PBS.
   7. יש לדגור על הנוגדן העיקרי בתמיסת קשירת נוגדנים (0.1% Triton X-100 ו-1% BSA ב-PBS) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נדנוד עדין. לדוגמה, השתמש 0.5 מ"ל עבור צלחת בקוטר 35 מ"מ.
      1. עקוב אחר המלצות היצרן לדילול נוגדנים. הערה: לדוגמה, נוגדן תג פפטיד קושר סטרפטווידין (SBP-tag) שימש בדילול 1:1,000, בעוד נוגדן PKN1 שימש בדילול 1:200.
   8. יש לשטוף 4x עם PBS.
   9. יש לדגור עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי מתאים בתמיסת קשירת נוגדנים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
      1. לדוגמה, השתמש Alexa 488 או Alexa 647 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
         1. עקוב אחר המלצות היצרן לדילול נוגדנים. (למשל, בערך 1:1,000 למחקר זה).
      2. הוסף כתמים אחרים לפי הצורך, לדוגמה, 5 מיקרומטר נבט חיטה agglutinin (WGA) מצומד Alexa 647 או DAPI על פי המלצת היצרן, במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   10. שטפו 5x עם PBS ואחסנו בטמפרטורה של 4°C, מוגן מאור עד לתמונה מוכנה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% תמיסת טריפסין-EDTA	סלגרו	25-050-סנטל'
קוביות אלקטרופורציה חד-פעמיות בקוטר 0.4 ס"מ	ביו-ראד	165-2088
100% מתנול	כלשהו	לא ישים	דליק, רעיל
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A4919
מנגנון ספירת תאים - המוציטומטר או מונה קולטר	בקמן קולטר	דגם Z1
חממת תרביות תאים	כלשהו	לא ישים	95% אוויר/5% CO2 אטמוספירה ב-37°C (75 °F)
פלסטיק תרבית תאים	כלשהו	לא ישים	צלוחיות / צלחות תרבית תאים, פיפטים, צינורות, שוטר גומי
שינוי מדיום הנשר של דולבקו (DMEM)	סלגרו	10-013	חם עד 37°C
אלקטרופורטור	ביו-ראד	אי קולי פולסר
סרום בקר עוברי (FBS)	סלגרו	35-016-CV
מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי	זיס	דגם LSM 710
כלי זכוכית תחתונים למיקרוסקופיה	ווילקו וולס	HBSt-3522
קו HeLa Cell	ATCC	ATCC CCL-2
מדיום חיוני מינימלי (MEM)	סלגרו	10-010	חם עד 37°C
כתמים פלואורסצנטיים אחרים (WGA, DAPI) בשילוב עם מגיב נגד דהייה	כלשהו	לא ישים
פניצילין/סטרפטומיצין	סלגרו	30-002-CL
RAW 264.7 קו תאים	ATCC	TIB-71
נוגדן ראשוני נגד יעד הריבית	כלשהו	לא ישים
נוגדן משני מצומד לפלואורופור	כלשהו	לא ישים
מלח חוצץ פוספט	כלשהו	לא ישים	מצננים ל-4°C
מלח סטרילי חוצץ פוספטים	כלשהו	לא ישים	חם עד 37°C
צנטריפוגה שולחנית המסוגלת לקבל צינורות חרוטיים (דלי מתנדנד מועדף)	כלשהו	לא ישים
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T8585	מגרה, רעיל