כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. טיפוח מלסזיה בתנאי מעבדה
הערה: אחסן את כל הריאגנטים והמדיה המשמשים לפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT, 20 – 25 ° C) אלא אם כן צוין אחרת, מכיוון שהטמפרטורה הנמוכה יותר יכולה לעכב צמיחת פטריות.
- הכינו את מדיום דיקסון (mDixon) שעבר שינוי נוזלי לגידול מלסזיה. להכנת 500 מ"ל של מדיום מדיקסון נוזלי, יש להמיס 18 גרם תמצית מאלט, 10 גרם מרה שור מיובשת, 5 מ"ל טווין-40, 3 גרם פפטון, 1 מ"ל גליצרול ו-1 מ"ל חומצה אולאית ב-500 מ"ל H2O מזוקק (dH2O). התאם את המדיום ל- pH 6 עם HCl ו- autoclave. אחסן את המדיום ב- RT.
- הכינו צלחות אגר mDixon על ידי הוספת 7.5 גרם אגר ל 500 מ"ל mDixon בינוני לפני autoclaving. קררו באיטיות את אגר mDixon לאחר אוטוקלאבינג באמצעות מוט היגוי ופלטת חימום מגנטית כדי למנוע התמצקות חלקית של המדיום בזמן הקירור.
- לאחר שהאגר התקרר ל 50 – 60 מעלות צלזיוס, שחררו את הנוזל לצלחות פטרי במכסה מנוע זרימה למינרית ותנו להם להתייבש ב- RT למשך הלילה.
הערה: ניתן לאחסן את צלחות האגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות כאשר הן עטופות ונשמרות הפוכות כדי למנוע אידוי.
- להשיג מבודדי Malassezia ולהחיות מלאי lyophilized של Malassezia על פי ההוראות שהתקבלו על ידי ספק.
- לחסן 10 מ"ל של מדיום mDixon נוזלי בבקבוק Erlenmeyer סטרילי 100 מ"ל עם השעיית Malassezia המחודשת על פי ההוראות שהתקבלו על ידי ספק. לדגור את התרבית באינקובטור רועד ב 30 מעלות צלזיוס ו 180 סל"ד.
- בדוק את הצמיחה של תרבות Malassezia באופן קבוע על ידי בדיקת המראה של צבע קרם ועכירות. קינטיקה של גדילה תלויה במין ובזן של Malassezia ועשויה להיות איטית במיוחד כאשר Malassezia קם לתחייה טרי מזן lyophilized. (איור 1A).
- הכינו מלאי גליצרול על ידי ערבוב 3 חלקים של תרבית מלסזיה צפופה במדיום mDixon עם חלק אחד של גליצרול סטרילי 99%. Aliquot תערובת Malassezia/glycerol לתוך צינורות פקק בורג סטרילי ולאחסן ב -80 ° C.
- עבור התפשטות במבחנה, צלחת Malassezia מן התרבית הנוזלית ב mDixon או מן מלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר mDixon (הביא RT מ 4 ° C) באמצעות לולאת חיסון.
הערה: העבר צלחות אגר mDixon ל- RT מ -4 מעלות צלזיוס לפני השימוש, מכיוון שאגר mDixon קר מעכב צמיחה פטרייתית.
- לדגור על צלחות אגר עם Malassezia הפוך באינקובטור aN (לא רועד) ב 30 ° C. בדוק את הצמיחה של מושבות Malassezia באופן קבוע.
הערה: מושבות מלסזיה על לוחות אגר mDixon מופיעות תוך 3-5 ימים והן בצבע קרם עמום, וחלקות עם גובה קמור (איור 1B).
- אחסן מושבות Malassezia על צלחות אגר mDixon ב RT במשך ~ 2 שבועות. לאחר מכן, הכינו צלחת אגר חדשה של mDixon על ידי פסים של Malassezia ממלאי הגליצרול הקפוא כמתואר ב-1.7.
2. הכנת החיסון לזיהום ניסיוני של עכברים
- חסן 10 מ"ל של מדיום mDixon נוזלי בבקבוק Erlenmeyer סטרילי של 100 מ"ל עם 3 - 5 מושבות Malassezia בודדות מצלחת אגר mDixon (ראה שלב 1, איור 1B).
- דגרו על תרבית המלסזיה במשך ~ 48 עד 96 שעות ב-30°C וב-180 סל"ד עד שהתרבית תהיה בצבע קרם ועכור (איור 1A).
הערה: הזמן הדרוש לצמיחת מלסזיה תלוי במין ובזן המלסזיה ובכמות הפטרייה המשמשת לחיסון.
- העבר 2 מ"ל של תרבית Malassezia לתוך צינור סטרילי 2 מ"ל מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב 10,000 x גרם.
- השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה על ידי השעייתו ב-1 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). צנטריפוגה שוב למשך דקה אחת ב 10,000 x גרם.
- לאחר השטיפה, להשהות את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS על ידי פיפטינג נמרץ ולמדוד את הצפיפות האופטית של התמיסה ב 600 ננומטר (ODA600) באמצעות ספקטרומטר. דללו את מתלה Malassezia 20 – 50 x עם PBS למדידת OD כדי להבטיח שהקריאה היא בין 0.1 ל- 1.
הערה: הצפיפות של תרבית 3 ימים של Malassezia בדרך כלל משתנה בין 15 ל 30 ODA600, בהתאם למין Malassezia ואת הזן ועל מספר תאי שמרים המשמשים לחיסון של התרבית (שלב 2.1). Malassezia נוטה ליצור אגרגטים, ולכן, pipetting נמרץ יש צורך להבטיח את הומוגניות של ההשעיה.
- Aliquot נפח של מתלה Malassezia ב PBS המתאים צפיפות של 4 ODA600 לתוך צינור סטרילי 2 מ"ל. הכינו צינורית אחת לכל בעל חיים כדי להידבק.
- צנטריפוגה צינורות המכילים Malassezia במשך 1 דקות ב 10, 000 x גרם.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות את כדורית המלסזיה ב-200 מיקרוליטר שמן זית מקומי (המקביל ל-2 תאי שמריםOD A600/100 מיקרוליטר שמן זית).
הערה: שמן זית נמצא ככלי טוב לזיהום אפיעורי במלסיה, שכן מלסזיה היא שמרים ליפופיליים ותלויי שומנים. שמן זית נספג טוב יותר על ידי העור מאשר PBS. עם זאת, להיות מודעים לכך שזה לא קל להשעות Malassezia בשמן זית. שפר את תרחיף המלסזיה / שמן זית על ידי מערבולת. שמור את המתלה ב- RT עד שהוא משמש לזיהום.
- הכינו צינורות עם שמן זית בלבד לזיהום מדומה של חיות ביקורת.
3. הדבקת עכברים במלזיה
- הזמינו נקבות עכברי C57BL/6 בגיל 6-8 שבועות ואפשרו להן להתאקלם במתקן הניסוי בבעלי חיים למשך שבוע לפחות. חשב עבור 3 - 5 עכברים לכל קבוצה, כולל קבוצת ביקורת לא נגועה.
- הכינו קוקטייל הרדמה סטרילי המכיל 1.3 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-6.5 מ"ג/מ"ל קטמין ב-PBS. 5 מ"ל של קוקטייל ההרדמה מספיק כדי להרדים 20 בעלי חיים. התאימו את עוצמת הקוקטייל בהתאם למספר בעלי החיים שיש להרדים.
- מרדימים בעלי חיים על ידי הזרקת 10 μL/g משקל גוף של קוקטייל הרדמה תוך צפקי (המקביל ל-65 מ"ג קטמין ו-13 מ"ג קסילזין לק"ג משקל גוף) ומניחים את בעלי החיים המורדמים על כרית חימום בטמפרטורה של 37°C.
הערה: במינון המצוין, בעלי חיים בדרך כלל נשארים מורדמים במשך ~ 30 - 60 דקות.
- בדוק את הרפלקסים על ידי צביטת הרגל האחורית במלקחיים כדי לוודא שבעלי החיים מורדמים לחלוטין.
- יש למרוח קרם עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההרדמה.
- לחלופין, למדוד את עובי האוזן של שתי האוזניים באמצעות קליפר (0 - 5 מ"מ טווח). מדדו שני אזורים שונים בכל אוזן וחשבו את עובי האוזן הממוצע לאוזן.
הערה: מדידת עובי האוזן היא אופציונלית ותלויה בשאלת המחקר. עם זאת, אם עובי האוזן משמש כקריאה לדלקת עור, יש צורך למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני ההדבקה. (ראה שלב 4).
- לחלופין, לשבש את מחסום האפידרמיס של עור האוזן הגבי על ידי הפשטת סרט עדינה: יש למרוח ידנית פיסת סרט קטנה על העור ולהסיר אותה שוב. חזור על הפעולה במשך 5 סיבובים רצופים באמצעות פיסת נייר דבק טרייה עבור כל סיבוב.
הערה: מלסזיה גורמת לדלקת עור בולטת יותר בעור עם הפרעה במחסום בהשוואה לעור לא מוטרד (איור 2A).
- יש למרוח באופן מקומי 100 μL (2 ODA600) של תרחיף מלציה/שמן זית על הצד הגבי של כל אוזן באמצעות פיפטה סטרילית. כלול קבוצת ביקורת של בעלי חיים המטופלים בשמן זית בלבד (קבוצת ביקורת שטופלה ברכב).
הערה: מערבבים את תרחיף המלסזיה/שמן זית במרץ כדי להבטיח תרחיף מלסזיה הומוגני מיד לפני היישום.
- השאירו את בעלי החיים המורדמים על כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה עד שהם מראים סימני התאוששות (תנועת שפם, קצב נשימה מוגבר וכו ').
- הזריקו 200 μL של תמיסת גלוקוז סטרילית ומחוממת מראש 2% באופן תת-עורי לתוך קפל העורף כדי לתמוך בחילוף החומרים ובהחזרת הנוזלים שלהם.
הערה: להכנת תמיסת גלוקוז סטרילית של 2%, יש להמיס 1 מ"ג גלוקוז ב-50 מ"ל PBS ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. ניתן לאחסן את התמיסה ב -4 מעלות צלזיוס.
- העבירו את החיות בחזרה לכלוב שלהן.
4. ניתוח דלקת עור הנגרמת על ידי מלסזיה
הערה: הליך זה מתאר את הניתוח של נפיחות אוזניים הנגרמת על ידי מלסזיה במהלך זיהום המשמש כפרמטר של דלקת עור. תנאי מוקדם לניתוח נפיחות האוזן הנגרמת על ידי פטרייה הוא למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני הפשטת סרט ו / או זיהום (שלב 3.5).
- הכינו תא איזופלורן להרדמה קצרת טווח של בעלי חיים נגועים במלסיה ובקרה.
- העבירו בעל חיים אחד בכל פעם לחדר והמתינו להרדמה מלאה.
הערה: סימנים של הרדמה נכונה כוללים הרפיה מלאה של הגוף, כמו גם נשימה איטית וכבדה (אגף). עקוב בזהירות אחר הרדמה מכיוון שחשיפה ממושכת לאיזופלורן עלולה להיות קטלנית.
- הוציאו את בעל החיים מהחדר והניחו אותו על רקמה.
- מדדו את עובי האוזן באמצעות קליפר (טווח 0 - 5 מ"מ). מדדו שני אזורים שונים בכל אוזן וחשבו את העובי הממוצע לאוזן (ראו שלב 3.5).
- מעבירים את בעל החיים בחזרה לכלוב.
הערה: הרדמה איזופלורנית היא קצרת מועד, ובעלי החיים מתאוששים תוך ~ 30 שניות לאחר הוצאתם מתא האיזופלורן.
- חשב את הגידול בעובי האוזן על ידי הפחתת עובי האוזן הבסיסי הממוצע, שנמדד לפני הפשטת הסרט ו / או זיהום, מעובי האוזן הממוצע שנמדד בכל נקודת זמן לאחר ההדבקה.
- שרטטו את הערכים המחושבים כגידול בעובי האוזן או, לחילופין, כעובי האוזן הכולל לאורך זמן עבור כל חיה או קבוצת חיות (איור 2B).
5. ניתוח נטל פטרייתי בעור הנגוע
- הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 2 מ"ל לכל אוזן לקציר, המכיל 0.5 מ"ל של P40 נונידט סטרילי 0.05% (NP40) ב-dH2O וכדור פלדה אוטוקלאבי (קוטר 5 מ"מ).
- שקלו את הצינורות באמצעות איזון מדויק ורשמו את המשקל המדויק.
- הרדימו את העכברים על ידי חנקCO2.
- הסר את האוזן (ים) בבסיס ולהעביר לתוך הצינור המכיל 0.5 מ"ל של 0.05% NP40 סטרילי ב dH2O, כמתואר בשלבים 5.1 - 5.2.
- לשקול את הצינור המכיל את רקמת האוזן ולחשב את המשקל בפועל של כל דגימה על ידי הפחתת משקל הצינור ללא האיבר ממשקל הצינור עם האיבר.
- הומוגניזציה של רקמת האוזן במשך 6 דקות ב 25 הרץ באמצעות הומוגנייזר רקמות. ודא כי הרקמה הומוגנית היטב.
- צלחת 100 μL של כל דגימה (המקבילה ל 1/5 מכל הומוגנט, מקדם דילול = 5) על לוחות אגר mDixon ולדגור על הלוחות הפוכים באינקובטור 30°C.
הערה: כמות המצופה הומוגנט צריכה להיות מותאמת בהתאם לעומס הפטרייתי הצפוי. הקפד צלחת הומוגנית מספיק כדי לקבל לפחות 10 ולא יותר מ 250 מושבות לכל צלחת כדי לאפשר ספירה קלה. לחלופין, לוחית צלחות מרובות לכל דגימה עם דילולים שונים של הומוגנאט.
- בדוק את הצמיחה של מושבות Malassezia באופן קבוע.
הערה: מושבות בדרך כלל להיות גלוי לאחר 2 - 3 ימים. הזמן הדרוש לצמיחתן של מושבות מלסזיה תלוי במין ובזן של מלסזיה.
- ספרו את המושבות לצלחת.
- חשב את מספר היחידות יוצרות המושבה, רקמת CFU/g באמצעות הנוסחה הבאה:
רקמת CFU/g = (מספר מושבות/צלחת) x (גורם דילול) / (משקל דגימת העור ב-g).
הערה: ניתן להעריך את מגבלת הזיהוי המינימלית המשוערת באמצעות הנוסחה הבאה: מגבלת גילוי מינימלית = (מושבה / צלחת אחת) x (גורם דילול) / (משקל ממוצע של כל דגימות העור ב- g).
- עומסים פטרייתיים בדרך כלל משורטטים בקנה מידה לוגריתמי (איור 2C).
