מודל זיהום מקרופאגים ממוין לחלוטין של תאים שמקורם במונוציטים עם Mycobacterium tuberculosis

תקציר

מקור: Mily, A., et al. קיטוב של M1 ו- M2 תאים שמקורם במונוציטים אנושיים וניתוח עם ציטומטריית זרימה על זיהום שחפת מיקובקטריום. J. Vis. Exp.(2020).

סרטון זה מדגים שיטה לחקר התגובות לזיהום Mycobacterium tuberculosis במקרופאגים מקוטבים של M1 ו-M2 שמקורם במונוציטים אנושיים. השימוש בציטומטריית זרימה מאפשר לחקור מגוון סמנים על פני השטח הקשורים לאוכלוסיות מקרופאגים נגועות ולא נגועות.

פרוטוקול

1. זיהום Mtb של תאים שמקורם במונוציטים

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים במתקן BSL-3.

1. יש להשהות מחדש את כדורית Mycobacterium tuberculosis (Mtb) בתווך RPMI ללא סרום בצינור סטרילי חדש של 50 מ"ל ולהתאים את ריכוז החיידקים הסופי לכ-5 x 10⁶ CFU/mL.
2. הסר את מדיום תרבית התאים מלוחות 6 בארות המכילים תאים שמקורם במונוציטים. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום סל"ד ללא סרום לכל באר. הוסף 1 מ"ל של תרחיף חיידקי לכל באר כדי לקבל ריבוי של זיהום (MOI) 5: 1, כלומר, 5 x 10⁶ CFU לכל 10⁶ מקרופאגים ב 2 מ"ל / באר לדגור את הלוחות במשך 4 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
3. לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה סטרילי כדי להסיר חיידקים תאיים. הטו את הצלחת והסירו בזהירות את כל חיץ הכביסה מהפינות. השהה מחדש את התאים שמקורם במונוציטים הנגועים ב- Mtb ב- 2 מ"ל של RPMI שלם בינוני ללא אנטיביוטיקה והמשך לזרימת צביעת ציטומטריה או דגירה על התאים למשך 24 שעות נוספות (או נקודות זמן אחרות) לפני ציטומטריית הזרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות קאמריות עם 8 בארות	לאב-טק	154534
RPMI 1640	תאגיד טכנולוגיות חיים	SH30096.01
IFN-γ	פפרוטק	300-02
נא-פירובט	GE Healthcare מדעי החיים	SH300239.01
ל-גלוטמין	GE Healthcare מדעי החיים	SH30034.01
פלקון 6 בארות לוחות תחתונים שטוחים	קורנינג מדעי החיים	353046
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא-אולדריץ'	F7524
GM-CSF	פפרוטק	300-03