כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. מקור עכבר ודיור
- יש להפיק עכברי LysM-eGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) המוחדר לאזור מקדם Lysozyme M (LysM) על רקע גנטי C57BL/6J כפי שתואר קודם לכן. גזור עכברי LysM-EGFP×MyD88-/- על ידי הצלבת עכברי LysM-EGFP עם עכברי MyD88-/- (חלבון התמיינות מיאלואידית ראשונית 88) על רקע C57BL/6J.
- עכברי בית בויבריום. עבור מחקרים אלה, בעלי חיים שוכנו באוניברסיטת קליפורניה, דייוויס בקבוצות לפני הניתוח ושוכנו בנפרד לאחר הניתוח. השתמש בעכברים בין הגילאים 10-16 שבועות.
2. הכנה וכימות חיידקים
- הסר את זן Staphylococcus aureus הביו-לומינסנטי המעניין מאחסון של -80 מעלות צלזיוס כדי להפשיר על קרח. פסים על צלחת אגר בדם בקר 5%. לדגור על הצלחת המפוספסת באינקובטור לח ב 37 ° C לילה (16 שעות).
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן SH1000 ALC2906. זן זה מכיל את פלסמיד המעבורת pSK236 עם החלבון קושר הפניצילין 2 מקדמי התמזגו לקלטת הכתב luxABCDE מבית Photohabdus luminescens.
- הכינו ציר סויה טריפטי (TSB) על ידי ערבוב 0.03 גרם אבקת TSB לכל מ"ל מים טהורים, ואוטוקלאבה TSB לעיקור. כאשר מקורר, להוסיף את כל אנטיביוטיקה הכרחית באמצעות טכניקה סטרילית. בפרוטוקול זה, הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של כלוראמפניקול ל- TSB כדי לבחור לביטוי של פלסמיד המעבורת pSK236, המכיל את קלטת ה- luxABCDE של ביולומינסנציה.
- בחר 3-4 מושבות נפרדות מצלחת S. aureus לתוך TSB עם 10 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol כדי להתחיל תרבית לילה. יש לדגור על חיידקים על שייקר דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (16 שעות).
- התחל תרבית חיידקים חדשה מתרבית הלילה על ידי דילול דגימה 1:50 לתוך TSB עם 10 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol. תרבית בשייקר דגירה ב-200 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס.
- שעתיים לאחר פיצול ה-S. aureus, נטרו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) על ספקטרופוטומטר. שימו לב ל-OD600 לעומת הזמן כדי למצוא צמיחה בשלב הלוגריתמי האמצעי. עבור זן SH1000 ALC2906, OD600 של 0.5 הוא אמצע לוגריתמי ומתאים לריכוז של 1 x 108 CFU/mL (CFU = יחידה יוצרת מושבה) (איור 1).
- כאשר OD600 הוא 0.5, שטפו חיידקים ביחס 1:1 עם מי מלח חוצצי פוספט (DPBS) קרים כקרח. צנטריפוגו את החיידקים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם ו-4°C. דקרו בזהירות את הסופרנאטנט והוסיפו היטב DPBS ומערבולות מקוררות נוספות. צנטריפוגה פעם נוספת למשך 10 דקות ב 3,000 x גרם ו 4 ° C.
- בזהירות decant supernatant. השהה מחדש את גלולת החיידקים בריכוז הרצוי. עבור מחקרים אלה, לאסוף 3 מ"ל של ALC2906 SH1000 ולהשהות מחדש ב 1.5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS), בקורלציה לריכוז חיידקים של כ 2 x 108 CFU/mL. יש לשמור חיידקים על קרח עד לשימוש.
- כדי לוודא את ריכוז החיידקים, יש לדלל 100 μL מדגימת החיידקים בקנ"מ 1:10,000 ו-1:100,000 ב-PBS. צלחת 20 μL aliquots על צלחת אגר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך 16 שעות. ספירת CFUs על ידי בדיקה גסה וחישוב ריכוז חיידקים למחרת.
3. פצעי עור כריתה וחיסון עם S. aureus
- יש לתת 100 μL של 0.03 מ"ג/מ"ל buprenorphine hydrochloride (~0.2 מ"ג/ק"ג) לכל עכבר באמצעות הזרקה intraperitoneal.
- עשרים דקות לאחר ההזרקה, מניחים 2-4 עכברים בתא עם 2-3 חמצן LPM עם 2-4% isoflurane. לאחר הרדמה מלאה של העכברים, העבירו את העכברים אחד בכל פעם לקונוס אף המחובר לחמצן 2-3 LPM עם 2-4% איזופלורן. ודא שהעכברים מורדמים במלואם על ידי צביטה חזקה של כל כפה אחורית בין האגודל לאצבע. המשך לשלב הבא אם החיה אינה מגיבה לצביטה.
- יש לגלח קטע בגודל 1 אינץ' על 2 אינץ' בגב העכבר בעזרת קוצצים חשמליים ולנקות את האזור מגזירי פרווה באמצעות מגבון נקי או גזה. הימנע משימוש תחליב depilatory כי זה עלול לגרום דלקת עודפת.
- נקה את גב העכבר תחילה עם 10% גזה ספוגה ביוד פובידון ולאחר מכן עם 70% גזה ספוגה אתנול. נקו את האזור בתבנית ספירלית, תוך תנועה החוצה ממרכז אזור הניתוח. יש להמתין כדקה לייבוש אזור הניתוח לפני הניתוח.
- החזק את גב העכבר המגולח באופן רופף בין שתי אצבעות ולחץ בחוזקה ביופסיית אגרוף סטרילית בקוטר 6 מ"מ במרכז אזור הניתוח המוכן. אין למשוך את העור מתוח.
- סובבו את ביופסיית הניקוב כדי ליצור מתאר עגול על העור שחותך את העור במלואו לפחות בחלק אחד של המתאר. היזהרו לא לחתוך לתוך הפאשיה או הרקמה שמתחתיה.
- השתמש במספריים סטריליים ומלקחיים כדי לחתוך דרך האפידרמיס והדרמיס בעקבות התבנית המעגלית המוטבעת על ידי ביופסיית הניקוב.
4. חיסון S. aureus
- מלאו מזרק אינסולין 28 גרם בחיסון החיידקי הרצוי. במחקר זה, יש לתת ריכוז של 1 x 108 CFU/mL (50 μL). אין לתת יותר מ-100 מיקרוליטר נפח.
- יש להזריק 50 מיקרוליטר של חומר חיסון בין הפאשיה לרקמה במרכז הפצע על גב העכבר. ודאו שהחיסון יוצר בועה במרכז הפצע עם מינימום דליפה או פיזור.
- משכו את הדרמיס הצידה, החזיקו את המזרק כמעט במקביל לרקמה, ולאט לאט דחפו את המזרק לתוך הרקמה עד שתורגש ירידה פתאומית בהתנגדות, המעידה על פירסינג של הפאשיה. בזהירות להוביל את המזרק למרכז הפצע ולהוציא את החיסון לאט. מוציאים את המזרק לאט מהחיה.
- הזריקו את אותו נפח של PBS סטרילי לפצעים של בעלי חיים לא נגועים כמתואר לעיל.
- להחזיר את החיה לכלוב שלה. הניחו את הכלוב מתחת למנורת חום או על גבי כרית חימום, והשגיחו על בעל החיים עד להחלמה מההרדמה.
5. ב- Vivo דימות ביולומינסנציה (BLI) והדמיית פלואורסצנטיות (FLI)
- אתחל את כל צלם החיות באמצעות תוכנת המכשיר. מרדימים עכברים בתא המקבל 2-3 חמצן LPM עם 2-4% איזופלורן. יש להזרים חומר הרדמה לקונוסים שבתוך מכשיר ההדמיה.
- הכניסו את העכבר הפצוע והנגוע למכונת הצילום. מקם את העכבר כך שהפצע יהיה שטוח ככל האפשר. השתמש בהגדרת הרצף הבאה כדי לצלם את העכברים.
- בחרו Luminescence and Photograph כמצב ההדמיה. זמן החשיפה הוא דקה אחת בבינינג קטן ו-F/stop 1 (הארה) ו-F/stop 8 (צילום). מסנן הפליטה פתוח. לחץ על לרכוש כפתור להקלטת התמונה.
- בחרו 'פלואורסצנטיות ותצלום' כמצב ההדמיה. זמן החשיפה הוא 1 s בבינינג קטן ו-F/stop 1 (פלואורסצנציה) ו-F/stop 8 (צילום) עם אורך גל עירור של 465/30 ננומטר ואורך גל פליטה של 520/20 ננומטר עם עוצמת מנורה גבוהה. לחץ על לרכוש כפתור להקלטת התמונה.
- החזירו את בעל החיים לכלוב והשגיחו עליו עד שיתאושש מההרדמה.
- דמיינו עכברים מדי יום כמתואר לעיל.
