מחקר לחקר תפקידו של ויטרונקטין בהיצמדות חיידקים לתאי אפיתל מארחים

תקציר

מקור: Singh, B. et al., Assays for Study the role of Vitronectin in Bacterial Adfusion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה לחקר תפקידו של ויטרונקטין בהיצמדות המופילוס אינפלואנזה לתאי האפיתל של המאכסן.

פרוטוקול

1. חקר היצמדות תלוית Vn של חיידקים לתאי אפיתל

1. תרבית תאי A549 (תאי אפיתל מכתשית מסוג II) בבקבוק תרבית^{רקמה בגודל 75} ס"מ עם מדיום F12 בתוספת 10% (vol/vol) נסיוב עגל עובר (FCS) (מדיום מלא) ו-5 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. לדגור את הבקבוק באינקובטור עם 5% CO₂ ב 37 ° C במשך 3 ימים עד 80% confluent (מפגש ניתן להעריך על ידי הדמיה כיסוי פני השטח על ידי התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך). ארבעת השלבים הבאים מתארים כיצד להכין את תאי האפיתל לבדיקה.
   1. לשטוף את monolayer התא בבקבוק פעמיים עם 20 מ"ל של PBS על ידי ערבול עדין. כדי לנתק את התאים משטח הבקבוקון, הוסיפו 2 מ"ל של תמיסת אנזים לניתוק תאים ודגרו על הבקבוק במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. הקישו על הבקבוק עם כף היד כדי לנתק את כל התאים ממשטח הפלסטיק. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפזר גושי תאים.
   2. הוסף 18 מ"ל של F12 מדיום שלם לבקבוק והעבר את כל מתלה התא לצינור פלקון סטרילי של 50 מ"ל. צנטריפוגו את מתלה התא למשך 5 דקות במהירות של 200 x גרם ב-RT והשליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של F12 בינוני מלא.
   3. הסר 10 μL של תרחיף התא ומניחים אותו בתוך צינור אפנדורף, ולאחר מכן להוסיף 90 μL של תמיסת Trypan כחול. טען את הדגימה לתוך המוציטומטר (עומק 0.1 מ"מ) לאחר הנחת הכיסוי.
   4. ספור את כל התאים הקיימים באזורים A, B, C ו- D (כל שדה מורכב מ- 16 ריבועים, ולכל ריבוע יש שטח של 0.0025 מ"מ²), ולאחר מכן חשב את מספר התאים הממוצע ([A+B+C+D]/4). חשב את מספר התאים למיליליטר באמצעות המשוואה הבאה:
      תאים קיימא / מ"ל = ספירת תאים ממוצעת × 10⁴ גורם דילול ×.
      הערה: כאן, גורם הדילול הוא 10.
   5. לדלל את תרחיף התא ל 5.0 x 10³ תאים/מ"ל באמצעות תווך שלם המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. יש לפזר 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות. לדגור על הצלחת ב 37 ° C ב 5% CO₂ עד התאים הם 90% נפגשים.
2. לפני זיהום חיידקי, להסיר את התווך מן הבארות ולהוסיף F12 בינוני (ללא FCS), ולאחר מכן לדגור לילה ב 37 °C (77 °F).
3. שטפו את חד-שכבת התא שלוש פעמים עם 500 μL של PBS ב-RT. הניחו את הצלחת על קרח והוסיפו 100 μL של תווך F12 מקורר מראש המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל של Vn. צלחתו על צלחת ב-4°C למשך שעה אחת. עבור בארות בקרה, להוסיף רק F12 בינוני.
4. לאחר הדגירה, יש להשליך את התמיסה על ידי צנרת ולשטוף את שכבת התא פעמיים עם 1 מ"ל PBS ב- RT.
5. מבודד קליני של תרבית Hif בעירוי מוח-לב (BHI) בינוני בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל NAD והאמין ב-37°C עם רעד ב-200 סל"ד. השתמש במדיום לוריא-ברטאני לתרבית E. coli. קציר Hif בשלב אמצע לוג (OD600 = 0.3) והשהה מחדש את החיידקים במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.2, המכיל 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) (חיץ חוסם; PBS-BSA). כוונן את המתלים ל- 10⁹ CFU / מ"ל. השהה מחדש תרבית של Hif M10 טרי במדיום F12 (2×10,⁸ CFU/מ"ל). הוסף 100 μL של תרחיף חיידקי זה לכל באר ודגר על הצלחת במשך 2 שעות ב 37 ° C.
   הערה: כל באר מכילה כ 2 x 10⁵ A549 תאים. עבור זיהום, 2 x 10⁷ CFU חיידקי נוספו, המקביל לריבוי של זיהום של 100.
6. הסר את המדיום על ידי pipetting ולשטוף את תאי אפיתל A549 שלוש פעמים עם PBS. הוסף 50 μL / באר של תמיסת ניתוק התא ודגר על הצלחת במשך 5 דקות ב 37 ° C.
7. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של F12 מדיום שלם לכל באר כדי לעצור את התגובה האנזימטית. מעבירים את תאי האפיתל (≈100 מיקרוליטר [כלומר, כל הנפח]) מכל באר לצינור זכוכית 6 מ"ל המכיל ארבעה חרוזי זכוכית. לפרוס את התאים ב RT על ידי מערבולות במשך 2 דקות.
8. לדלל 10 μL של התא lysate פי 100 על ידי הוספת 10 μL של lysate ל 990 μL של תווך F12. צלחת 10 μL של הדגימה המדוללת על צלחת אגר שוקולד.
9. לדגור על צלחת אגר שוקולד ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה, ולאחר מכן לספור את המושבות. כל מושבה מייצגת CFU.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול	BD בז	60819-138	סגנון 12 × 75 מ"מ
אינקובטור מסופק 5% CO2	תרמו סיינטיפיק	BBD6220
6 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול	VWR	89000-478	סגנון 12 × 75 מ"מ עם מכסה
צלחות 24 בארות	BD בז	08-772-1H	כיתה בתרבית תאים
75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמה	BD בז	BD353136	פרקו
A549 קו תאים אנושי	סיגמא-אולדריץ'	86012804-1VL
אנזים ניתוק תאים (Accutase)	סיגמא-אולדריץ'	A6964-500ML	דרגת תרבית תאים
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A2058	מתאים לתרבית תאים
F12 בינוני	סיגמא-אולדריץ'	D6421	דרגת תרבית תאים
סרום עגל עובר (FCS)	סיגמא-אולדריץ'	12003ג	מתאים לתרבית תאים
המוציטומטר	מרינפלד	640210
בקבוק תרבית רקמה	BD בז	3175167	75 ס"מ2
ויטרונקטין (Vn) מפלזמה אנושית	סיגמא-אולדריץ'	V8379-50UG	כיתה בתרבית תאים