מאמר שיטה

קביעת תפקידו של ויטרונקטין בעמידות חיידקית לפעילות חיידקית של סרום אנושי

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Singh, B. et al., Assays for Study the role of Vitronectin in Bacterial Adfusion and Serum Resistance.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את תפקידו של ויטרונקטין, גליקופרוטאין בסרום אנושי, על עמידות חיידקים. נוגדנים בסרום אינטראקציה עם חלבונים פני השטח חיידקי, הפעלת חלבונים משלימים ויצירת קומפלקס לתקוף את הממברנה, גרימת ליזה של תאים חיידקיים. קישור ויטרונקטין לחלבון קרום החיידק מונע היווצרות קומפלקס של תקיפת הממברנה, וכתוצאה מכך הישרדות חיידקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. ניתוח עמידות תלוית Vn לפעילות חיידקית של סרום אנושי

  1. רכוש סרום אנושי רגיל (NHS) ממקור מסחרי. הכינו ויטרונקטין או סרום מדולדל Vn (VDS). חדש את VDS עם 180 nM Vn אשר שווה ערך Vn הנוכחי NHS.
  2. הכינו סרום מומת חום (HIS) על ידי חימום NHS ב 56 °C למשך 30 דקות על מנת להשבית חלבונים משלימים.
    הערה: ריכוז הסרום האופטימלי (5%) וזמן הדגירה (15 דקות) לבדיקה נקבעו אמפירית עבור המופילוס אינפלואנזה מסוג f (Hif); פרמטרים אלה עשויים להשתנות עבור פתוגנים חיידקיים אחרים.
  3. תרבית חיידקים (במקרה זה, Hif M10 והמוטנטי Hif M10Δlph) לשלב אמצע לוג (OD600 = 0.3). חיידקי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 3,500 x גרם במשך 10 דקות.
  4. יש להשהות מחדש את כדורית החיידקים עם נפח 1 של דקסטרוז ג'לטין חיץ ורונלי (DGVB++; pH 7.3) המכיל 2.5% (w/v) גלוקוז, 2 mM מגנזיום כלורי, MgCl2, 0.15 mM סידן כלורי, CaCl2, ו 0.1% (wt/vol) ג'לטין.
  5. הוסף 1.5 x 103 יחידה ליצירת מושבה (CFU) של חיידקים ל 100 μL של DGVB++ המכיל 5% סרום (NHS, HIS, VDS, או VDS+180 nM Vn). יש לדגור על הדגימה בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות עם רעידות ב-300 סל"ד.
  6. מוציאים אליציטוט של 10 μL מתערובת התגובה ב-0 דקות (דגימת T0) ו-15 דקות (דגימת Tt) וצלחת על אגר שוקולד. לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך הלילה.
  7. לאחר הדגירה, לספור את המושבות המופיעות על הצלחת. חשב את אחוז החיידקים שהומתו באמצעות המשוואה הבאה: (יחידת יצירת מושבה או CFU ב- Tt)/(CFU ב- T0) × 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול VWR89000-478סגנון 12 × 75 מ"מ עם מכסה
סרום אנושי רגיל (NHS)Complement טכנולוגיה, Inc.NHSסרום אנושי במצטבר
סידן כלורי (CaCl2)סיגמא-אולדריץ'C5670-500G
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-1 ק"ג
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G9391מתאים לתרבית תאים
המוציטומטרמרינפלד640210
מגנזיום כלורי (MgCl2)סיגמא-אולדריץ'M8266-1KG
ויטרונקטין (Vn) מפלזמה אנושיתסיגמא-אולדריץ'V8379-50UGכיתה בתרבית תאים
שאכר סטיוארט סיינטיפיקSTR6מנער פלטפורמה

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CFUDGVB

מאמרים קשורים