מודל זיהום ברירית צוואר הרחם האנושי לחקר פתוגנזה של HIV בתנאי Ex Vivo

תקציר

מקור: Introini, A., et al., Ex Vivo זיהום של רקמת הלימפה האנושית ורירית איברי המין הנשית עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 והיסטוקולטור. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים זיהום ex vivo של רקמת רירית הרחם האנושית עם וירוס הכשל החיסוני האנושי מסוג 1, HIV-1, ותחזוקתם על גבי ספוגי ג'לטין בממשק אוויר-נוזל. שיטה זו מאפשרת ניטור של שכפול HIV-1 ופתוגנזה בתוך רקמות אנושיות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. דיסקציה וזיהום של רירית צוואר הרחם

הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, צמחים של רירית צוואר הרחם צריכים להיות מעובדים ונגועים בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, באופן אידיאלי באותו יום של הניתוח. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות שקועות ב-CMT (מצע תרבית בתוספת אנטיביוטיקה) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולהדביק אותן מיד לאחר הנתיחה.

1. יש לאפשר ל-CM מספיק זמן להגיע ל-RT או להכניס אותו לאמבט מים שחומם מראש ב-37°C. יש להוסיף ל-CM תמיסת אנטיביוטיקה (CMT) לפני השימוש. יש להשליך שאריות של תמיסת אנטיביוטיקה. יש לשפוך תמיסת אתנול 70% למיכל נקי כדי להשרות את המלקחיים והאזמל בעת הצורך במהלך הליך הנתיחה. נקו את הכלים והחליפו את להב האזמל בין נתיחות של דגימות מתורמים מרובים.
2. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים את הדגימה ממיכל ההובלה לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10-20 מ"ל CMT.
3. השתמש במכסה של צלחת פטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה. החזקת הרקמה בעדינות עם מלקחיים, להפריד את הרירית של ectocervix ו / או endocervix מן הרקמה סטרומה מתחת ושרירי (submucosa) עם אזמל ולהב כדי לקבל רצועות של רירית.
   הערה: בזמן העבודה על פיסת רקמה אחת, חשוב לשמור על שאר הרקמה שקועה בתווך כדי למנוע התייבשות רקמה.
4. חותכים את הרירית לרצועות ברוחב 2 מ"מ, ומוציאים ומשליכים כמה שיותר תת-רירית, ומשאירים רק שכבת רקמה בעובי 2 מ"מ. חותכים את הרצועות לגושים בעובי 2 מ"מ. זה אמור לגרום לצמחי רקמה של בערך 8 מ"מ³.
   זהירות: טיפול בכלים חדים לניתוח דגימות אנושיות מגביר את הסיכון לפציעה ולזיהום. על המפעיל לשקול ללבוש כפפות מתכת, רשת וכפפות עמידות בפני חתכים כהגנה נוספת.
5. מעבירים את הצמחים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה 10-20 מ"ל CMT כדי למנוע התייבשות של הרקמה תוך כדי המשך הדיסקציה. בסוף הדיסקציה, מערבלים את הצלחת כדי לסדר באופן אקראי את התפלגות החציל.
6. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את החצילים לתוך הצינור(ים) החרוטיים הסטריליים בנפח 1.5 מ"ל (מקסימום 16 אקספורטים לכל צינור). הסר כל מדיום בצינור באמצעות פיפטה.
7. הפשיר את הכנת HIV-1 באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. במידת הצורך, לדלל את מלאי הנגיף עם CM. להעביר את הנגיף לתוך הצינור(ים) המכילים את explants. יש להשליך כל שאריות של הכנת וירוס.
   הערה: יש לדלל את מלאי הנגיף כך שהחיסון שנבחר ייכלל בנפח של מינימום 0.5 מ"ל (טבלה 1). כדי להפחית את שונות התוצאות בין ניסויים בלתי תלויים, יש להשתמש באותה הכנת וירוס למחקר שלם (Table of Materials).
8. מעבירים את הצינורות לשייקר תרמי ודגרים במשך שעתיים ב-37°C כשהם מתנדנדים ב-300 סל"ד. הפוך בעדינות את הצינורות כמה פעמים כל 30-60 דקות.
   הערה: עבור זיהום יעיל, זה קריטי להשתמש בזמן המינימלי הדרוש בין הפשרת הכנה HIV-1 והעברת צינורות ל 37 ° C.
9. ממלאים צלחת בת 6 בארות ב-3-4 מ"ל לכל באר של מלח חיץ פוספט סטרילי (PBS). בשלב הדגירה עם HIV-1, יש להשליך את כל הכנת הנגיף בצינור(ים) למיכל עם תמיסת חיטוי באמצעות פיפטה. מעבירים את העציצים לצלחת בעלת 6 בארות המכילה PBS באמצעות מלקחיים.
10. הניחו לצמחים לנוח ב-PBS למשך דקה אחת ב-RT, ולאחר מכן שטפו אותם על ידי פיפטציה עדינה מעלה ומטה של ה-PBS לתוך הבאר 2-3 פעמים. יש להשליך את ה-PBS למיכל עם תמיסת חיטוי באמצעות פיפטה. הוסף 3-4 מ"ל של PBS חדש לכל באר. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות במשך שלוש כביסות בסך הכל. יש להשליך את PBS ממש לפני העברת הצמחים לספוגים כדי למנוע התייבשות רקמות.
    הערה: צמחים של רירית צוואר הרחם, ובמיוחד endocervix, לשחרר כמויות גדולות של ריר במהלך ההדבקה. זה קריטי לשטוף ולהסיר כמה שיותר ריר כי שמירה לא ספציפית על צמחים ולאחר מכן שחרור של וירוס לתוך supernatant תרבית יכול להסוות שכפול וירוס.
11. בעזרת מלקחיים, מעבירים 5-8 חצילים מעל כל ספוג ג'לטין בצלחת של 12 בארות. מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
12. יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית במיכלים מנוגדים בהתאם לתקנות המכון לטיפול בחומרים ביולוגיים מסוכנים והערכת הסיכונים הספציפיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ג'לפואם 12-7 מ"מ ספוג ג'לטין נספג	פייזר	NDC: 0009-0315-08	Gelfoam ו Spongostan ביצועים טובים באותה מידה בהיסטוקטורה הן עבור רקמת שקדים והן עבור רקמת צוואר הרחם.
SPONGOSTAN סטנדרטי 70 × 50 × 10 מ"מ ספוג ג'לטין המוסטטי נספג	Ferrosan מכשור רפואי	MS0002	Gelfoam ו Spongostan ביצועים טובים באותה מידה בהיסטוקטורה הן עבור רקמת שקדים והן עבור רקמת צוואר הרחם.
RPMI 1640 עם פנול אדום וגלוטמין	תרמופישר סיינטיפיק	21875034	כדי RPMI1640 להוסיף MEM חומצות אמינו לא חיוניות, פירובט נתרן, gentamicin, amphotericin B ו- FBS 15% (v/v) כדי להפוך את התרבית בינונית (CM).
מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) pH 7.4 w/o סידן, מגנזיום ופנול אדום			לשימוש לאחסון והובלה של דגימות כירורגיות. PBS יכול להיות מוחלף עם פתרון איזוטוני אחר עם pH פיזיולוגי. מדיום תרבות הוא הטוב ביותר לאחסון לילה.
מים סטריליים באיכות תרבית תאים
תמיסת אתנול 70%
תמיסת חיטוי לסילוק פסולת ביולוגית
מלקחיים סטריליים ממתכת או פינצטה
מספריים סטריליים ממתכת
מרית מתכת סטרילית שטוחה במשקל
אזמלים ולהבים סטריליים
צלחות תרבית תאים 6 בארות
צלחת פטרי סטרילית, 100 מ"מ × 20 מ"מ
הכנה ויראלית ללא תאים HIV-1 HIV-1BaL	תוכנית ריאגנטים לאיידס של NIH	510	הנגיף צריך להיות מופץ כדי ליצור מלאי גדול מספיק כדי לבצע כמה ניסויים. השעיית וירוס Aliquote ולאחסן ב -80 ° C. יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
הכנה נגיפית ללא תאים HIV-1 HIV-1LAI.04	תוכנית ריאגנטים לאיידס של NIH	2522	הנגיף צריך להיות מופץ כדי ליצור מלאי גדול מספיק כדי לבצע כמה ניסויים. השעיית וירוס Aliquote ולאחסן ב -80 ° C. יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
צינורות פקק בורג סטריליים 1.5 ו -2 מ"ל
אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס
ארון בטיחות ביולוגי
שייקר אמבטיה יבש עם בלוק חימום עבור צינורות 1.5 מ"ל, מוגדר על 37 ° C, 300 סל"ד