$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. מדידה של סוג I-I IFN ביו-אקטיבי באמצעות תאי דיווח HEK-Blue IFN-α/β.
הערה: תאים אלה נוצרו על ידי טרנספקציה יציבה של תאי HEK293 עם הגנים האנושיים STAT2 ו- IRF9 כדי לקבל מסלול איתות פעיל לחלוטין מסוג I IFN. הם מכילים גם את הגן המדווח אלקליין פוספטאז (SEAP) המופרש תחת שליטתו של מקדם ISG54 המושרה IFN-α/β. גירוי של תאים אלה עם סוג I IFN מפעיל את מסלול JAK/STAT/ISGF3 וגורם לייצור SEAP.
- שמור על תאי HEK-Blue IFN-α/β ב- DMEM בתוספת FBS של 10%. לוחים אותם בצפיפות של 50,000 תאים לבאר בצלחת שטוחה בעלת 96 בארות, עם נפח סופי של 180 מיקרוליטר.
- ערבבו 220 μl של PBMCs (מדולל ב-850,000 תאים/מ"ל) או 220 μl של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים (pDCs) (בריכוז שנע בין 100,000 ל-500,000 תאים/מ"ל) עם 30 μl של תאי T נגועים (מדוללים ב-10,6 תאים/מ"ל) לכל באר בצלחת U-bottom 96 well.
- דגרו על תרביות משותפות בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 18-22 שעות, ולאחר מכן העבירו אותן לצלחת באר V-bottom 96. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x גרם.
- הוסף 20 μl של supernatant תרבות משותפת לכל באר כפול. כל צלחת דורשת גם סט של בקרות סטנדרטיות פנימיות (IFNα אנושי, ריכוז סופי מ-100 U/ml עד 2,500 U/ml). לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 18-22 שעות.
- קבע את רמות הפעילות של phosphatase אלקליין באמצעות תמיסת QUANTI-Blue, אשר משתנה מוורוד לסגול / כחול בנוכחות האנזים. הכינו את QUANTI-Blue בהתאם להמלצות היצרן. הוסף 180 μl של פתרון זה לכל באר של צלחת שטוחה 96 באר. לכל באר מוסיפים גם 20 μl של תאי העל המושרים HEK-Blue IFN-α/β ודוגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד להתפתחות הצבע בבארות הבקרה הסטנדרטיות של IFN.
- הערך רמות של SEAP באמצעות ספקטרופוטומטר ב- 620-655 ננומטר וקבע את הריכוז של IFN מסוג I על ידי אקסטרפולציה מהחלק הליניארי של עקומת תקן IFN.