טכניקה ליצירת חלקיקים דמויי נגיף שפעת באמצעות מערכת יונקים

תקציר

מקור: Arevalo, M. T., et al.ביטוי וטיהור חלקיקים דמויי וירוס לחיסון. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את היווצרותם של חלקיקים דמויי נגיף שפעת (VLPs) במערכת יונקים. לאחר שהם מבטאים שלושה וקטורי ביטוי אאוקריוטים – המקודדים חלבונים מבניים נגיפיים שונים – בתאים מארחים מתאימים של יונקים, החלבונים הנגיפיים המבוטאים מתאספים בעצמם ל-VLPs על קרום הפלזמה המארח ומשחררים באמצעות ניצנים מפני השטח של התא.

פרוטוקול

1. מערכת ביטוי יונקים לייצור שפעת H3N2 VLP

1. תת-שיבוט של גליקופרוטאינים מבניים נגיפיים המגלוטינין (HA), נוירמינידז (NA) ונגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) Gag (אנטיגן ספציפי לקבוצה) p55 לווקטורי ביטוי אאוקריוטיים, כגון pTR600 שתואר קודם לכן.
2. להגביר DNA ב- Escherichia coli בעל יכולת כימית (למשל, DH5α) ולבודד פלסמיד בדרגת טרנספקציה באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. כמות הדנ"א תלויה בתפוקה ובצרכי המשתמש.
3. שמור על קו תאי יונקים, 293T, במצע גדילה המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ב 37 ° C עם 5% CO₂ באינקובטור לח.
4. לגדל תאים כך שבקבוק תרבית רקמה T-150 מכיל 45-75 x 10⁶ תאים לכל בקבוק, כך שהבקבוק מקבל היצמדות מלאה לתאים ומפגש תאים של 85-95% עד למחרת. בדוק תאים תחת המיקרוסקופ עבור המפגש הרצוי.
   הערה: צפיפות תאים גבוהה מומלצת בדרך כלל כדי להניב ביטוי חלבון אופטימלי עם ציטוטוקסיות מינימלית בעת שימוש בריאגנטים מסחריים של טרנספקציה, אולם מפגש יתר עלול לגרום להצטברות של תוצרי לוואי של פסולת תאית ולהפחית את כדאיות התא.
5. ביום הטרנספקציה, הכינו תערובת ליפוזום ו- DNA בהתאם להמלצות היצרן והדביקו תאי DNA עם הרכב DNA של 1:1:2 של HA:NA:Gag עם כמות DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לכל צלוחיות T-150. לדלל DNA ותמיסות ליפוזום באמצעי טרנספקציה ללא נסיוב ללא אנטיביוטיקה כך שכל בקבוק מכיל נפח כולל של 20-30 ml.
   הערה: היחס בין מבני גנים עשוי לדרוש אופטימיזציה של המשתמש. למרות שלא הודגם כאן, הליך טרנספקציה דומה בוצע עם וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV) F ו- HIV Gag ביחס של 1:1. עבור פלסמידים בעלי ביטוי יחיד DENV ו- CHIKV, סך של 20 מיקרוגרם DNA לכל בקבוק T-150 משמש לביטוי אופטימלי. DNA:יחסי מגיב טרנספקציה ממוטבים למשתמש. השתמש באמצעי טרנספקציה מומלץ המבוסס על שיטת טרנספקציה, כלומר, טרנספקציות שומנים פוליקטיוניות ממליצים על הפחתה או היעדר של סרום בקר עוברי ובכך ניתן להשלים מדיה עם הורמוני גדילה ויסודות קורט לתמיכה בגדילה בהיעדר סרום.
6. להחזיר צלוחיות ל 37 ° C עם 5% CO₂ אינקובטור. לקבלת נפח של 200 מ"ל, השתמש 9 צלוחיות T-150. התאים נשמרים בתווך תרבית טרנספקציה עד ליום קציר ה-VLP.
7. קציר תרבית supernatant מתאים לאחר 72-96 שעות לאחר transfection בהתאם לאנטיגן, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80%, כפי שהוערך על ידי בדיקה מיקרוסקופית. להעביר supernatant לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל ולסובב את התאים למטה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי פסולת תאית גלולה.
   הערה: החלפה של סופרנאטנט בן 3 ימים באמצעי טרנספקציה טריים שחוממו מראש וללא סרום לתאים דבקים תניב כמות שנייה של VLPs עם תפוקה דומה או מופחתת מעט, והמשתמש צריך למטב אותה.
8. יש לסנן דרך קרום נקבובי בקוטר 0.22 מיקרומטר לפני שיקוע באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת מקסי פלסמיד	קיאגן	12163
DMEM	סלגרו	10-013
ליפופקטמין	לייף טכנולוגיות	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	לייף טכנולוגיות	31985062
Cimarec I 6 צלחת ערבוב רב נקודתית	תרמופישר סיינטיפיק	50094596
צינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקליר	סיטון	7025
ראש מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר (500 מ"ל)	נלג'ין	569-0020
גליצרול	סיגמא	G5516