מאמר שיטה

יצירת חלקיקים דמויי וירוס Chikungunya באמצעות מערכת ביטוי Baculovirus בתאי חרקים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Arevalo, M. T. et al., ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס לחיסון.J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מראה כיצד חלקיקים דמויי וירוס, VLPs נוצרים על ידי הדבקת תאי חרקים בבקולווירוס רקומביננטי הנושא את קלטת הגן של נגיף הצ'יקונגוניה. הנגיף הרקומביננטי מדביק תאים, מה שמוביל להיווצרות, הרכבה ושחרור של VLP למדיום התרבית לשימוש פוטנציאלי בייצור חיסונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי חלקיקים דמויי וירוס Chikungunya (VLP) באמצעות Baculovirus/מערכת תאי חרקים

  1. צור baculovirus רקומביננטי המבטא chikungunya virus capsid וחלבוני מעטפת (C-E3-E2-6K-E1) מזן S-27 באמצעות מערכת ביטוי baculovirus מסחרית.
  2. תרבית Spodoptera frugiperda Sf9 תאים במדיום גידול Sf9 ללא סרום עם 100 U/ml פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ב 28 ° C. השתמש 3-5 x 105 c/ml כדי ליזום תרביות בקבוק ספינר לצמיחת תאי תרחיף. המעבר באופן שגרתי כאשר הם מגיעים לצפיפויות תאים של 2-4 x 106 c/ml (כל 3-4 ימים).
  3. תרבית תאי Sf9 בתרחיף בצלוחיות ספינר עם ערבוב ב-130 סל"ד במערכת פלטות מערבל רב-נקודתית. לאוורור נכון, שמרו על נפחי תרבית בלא יותר ממחצית נפח בקבוק הספינר.
  4. לביטוי של Chikungunya או CHIK VLPs, להדביק תאי Sf9 בצפיפות של 2 x 106 תאים / ml עם baculovirus רקומביננטי במכפלה של זיהום של 1 ולחזור אינקובטור 28 ° C. בדרך כלל, להדביק בקבוק ספינר אחד או שניים, המכילים 250 מ"ל Sf9 תאים.
    הערה: אמנם איננו משתמשים בשיטה זו, אך ניתן לגדל תאי Sf9 בתרבית בצלוחיות שייקר בטמפרטורה של 28°C באמצעות פלטפורמת שייקר.
  5. תרביות קציר לאחר 72-96 שעות לאחר ההדבקה, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80% כפי שנקבע על ידי Trypan Blue Exclusion על פי פרוטוקול היצרן.
    הערה: התאים ממשיכים להתרבות בזמן שהם נגועים ויש ~ 80% כדאיות בתרביות Sf9 נגועות רקומביננטי CHIK VLP baculovirus ב 3 ימים לאחר ההדבקה (dpi). תאים נגועים Baculovirus הם גדולים יותר במראה. גם המורפולוגיה עשויה להשתנות מעגולה למלבנית. בשלבים המאוחרים של זיהומים baculovirus, התאים החלו לשכב.
  6. העבר תרביות ישירות מתרבית תרחיף לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל וסובב את התאים למטה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. אספו סופרנאטנטים וסננו דרך קרום נקבוביות של 0.22 מיקרומטר לפני שיקוע באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Opti-MEM Iלייף טכנולוגיות31985062
מערכת ביטוי Bac-to-Bac Baculovirusלייף טכנולוגיות10359-016
ראש מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר (500 מ"ל)נלג'ין569-0020
SFM Sf-900 IIתרמופישר סיינטיפיק10902-096
Cimarec I 6 צלחת ערבוב רב נקודתיתתרמופישר סיינטיפיק50094596

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VLPsSf9VLP

מאמרים קשורים