כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. טיפול בבעלי חיים, הכנה והשראת דלקת
- השתמש בעכברים זכרים בני 4 - 6 שבועות עם טווח משקל של 16 - 20 גרם. הערה: אם העכברים מבוגרים או כבדים יותר הם מציגים שומן עודף סביב כלי השיט, מה שמגביל את התצפית המיקרוסקופית.
- יש לעקר את כל הכלים ואת טבלת המיקרוסקופ לפני הניתוח.
- יש להזריק 20 מ"ג/ק"ג LPS (lipopolysaccharide) תוך צפקית 4 שעות לפני המיקרוסקופ לעכבר החי כדי לגרום לדלקת חיידקית.
- חממו מראש תמיסת מלח 0.9% באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי לחלח את תא הפלסטיק ואת רקמת המזנטריה.
- מרדימים את העכבר בהזרקה תוך צפקית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג) ממש לפני הליך המיקרוסקופ. ניתן להשתמש בהרדמה חלופית, למשל שאיפת איזופלורן 2%. לאשר הרדמה נאותה על ידי אובדן התגובה לגירוי רפלקס (צביטת בוהן או זנב בלחץ חזק).
- Depilate את הבטן באמצעות מכונת גילוח ולהסיר שיער רפוי עם גזה רווי אתנול 70%.
- יש למרוח משחה וטרינרית על עיני העכבר כדי למנוע יובש, בזמן הרדמה.
2. ניתוח
- לעקר את הבטן באמצעות 70% אתנול. שיטה זו אינה שיטה סטרילית ועלולה להיות קטלנית בסוף הניסוי.
- ביצוע לפרוטומיה חציונית: יש לפתוח את עור הבטן באמצעות מלקחיים קטנים ומעוקלים ומספריים קטנים. לזהות את כלי epigastric ולפתוח את הצפק באזור linea alba, כדי להגן על כלי.
- מרחו כמה טיפות של מי מלח שחוממו מראש לתוך חלל הבטן כדי לשמור על לחות הרקמה.
- יש לתייג לויקוציטים וטסיות דם באופן פלואורסצנטי על ידי הזרקת 50 μl רודאמין 6G (1 מ"ג/מ"ל) רטרו-מסלולית.
- הגדירו לולאה של אילאום והניחו אותה בכלי פטרי בקוטר של 10 ס"מ; הקפידו לשמור על לחות הרקמה על ידי מריחת תמיסת מלח שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (0.9%) כל דקה שנייה.
3. מיקרוסקופיה תוך-חיונית
- מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ומביאים את וריד המזנטרי בקוטר של 200 - 300 מיקרומטר במרכז הראייה. בחר כלי ללא סביבת שומן נראית לעין.
- אין לגעת בכלי המזנטריה ובכך להימנע מגירוי של האנדותל. טפל בלולאת האילאום בזהירות.
- דמיינו אינטראקציות בין תאי דם לאנדותל בעזרת מיקרוסקופ הפוך או זקוף ומצלמה באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. הקלט אינטראקציות תאי דם-אנדותל במשך דקה אחת ב-4 ורידים שונים לכל עכבר.
- להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם לאחר השלמת ניסויי הדמיה.
4. ניתוח
- בצע את הניתוח במצב לא מקוון ועיוור לכל הפרמטרים. לבצע ניתוח באמצעות כל תוכנה מתאימה.
- אשר תנאי זרימת דם יציבים ובין-אישיים דומים בסרטוני cine-clips ברזולוציית זמן גבוהה (קצב פריימים מרבי) המתמקדים בזרימת תאי דם תוך לומינליים.
- לכמת את מספר לויקוציטים מתגלגלים. לכן, ציירו קו אנכי דרך הווריד וספרו את כל הלויקוציטים שחוצים קו זה בדקה אחת.
- קבע את מהירות הגלגול על ידי מדידת הזמן שלויקוציטים בודדים צריכים לעבור מרחק של 50 מיקרומטר תוך גלגול יציב על האנדותל. כדי לעשות זאת, לצייר שני קווים אנכיים במרחק של 50 מיקרומטר דרך הווריד.
- למדוד את הזמן לויקוציטים נציג צריך להגיע מקו אחד למשנהו. חשב את המהירות של לויקוציטים על ידי חלוקת 50 מיקרומטר דרך הזמן הדרוש (μm / s).
- למדוד הידבקות לויקוציטים בשדה של 0.04 מ"מ2. כדי לעשות זאת, לצייר ריבוע עם אורך צד של 200 מיקרומטר לתוך הווריד.
- ספרו את הלויקוציטים הדבקים המוצקים, המוגדרים כחסרי תנועה נראית לעין במשך 30 שניות, בתוך ריבוע זה.
- ספור את מספר הטסיות הקשורות לויקוציטים אחד כדי לכמת אינטראקציות טסיות-לויקוציטים.
