כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת אנטיגן להזרקה תת עורית
- בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתוך מכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה או מגע עור עם Mycobacterium tuberculosis, אבקת Mtb H37Ra. טפל בהתאם למדיניות המוסדית שלך עבור האדג'ובנט של Complete Freund (בדרך כלל BSL-1). זה כולל שימוש בכפפות עמידות בפני כימיקלים, משקפי בטיחות ובגדי עבודה מגנים (מעיל מעבדה).
- השתמש בטכניקה סטרילית טובה כדי למנוע זיהום של ריאגנטים שיוכנסו לבעלי חיים ניסיוניים.
- הפוך את תרחיף Mtb במי מלח חוצצים פוספט (PBS) על ידי ערבוב 5 מ"ג של אבקת Mycobacterium tuberculosis H37Ra ליופילית, מומת בחום עם 2.5 מ"ל של PBS קר בצינור מיקרוצנטריפוגה 5 מ"ל. מערבלים פעם אחת למשך 30 שניות ואז מניחים על קרח.
- כדי ליצור מתלה עדין של H37Ra ב-PBS, הפעילו את המתלים על קרח למשך 5 דקות.
- שחרר את הידוק הגוף של יחידת הממיר ונקה את הבדיקה עם מקלון אלכוהול 70% (v/v).
- הפעל את הסוניקטור, כוונן את הגדרת ההפעלה ל-4 על-ידי סיבוב ידית בקרת ההפעלה, וטבול את קצה הגשושית באבקה מיקובקטריאלית המכילה PBS. ודא שקצה הבדיקה שקוע לפחות במחצית מעומק הדגימה ושקצה הבדיקה אינו נוגע בדופן צינור המיקרוצנטריפוגה.
- ערבבו את התערובת על קרח למשך 30 שניות, עצרו למשך 30 שניות וחזרו על הפעולה במשך 5 דקות בסך הכל כדי לפזר את האבקה במלואה לתרחיף אחיד מבלי לחמם את הנוזל.
- מוסיפים 2.5 מ"ל של האדג'ובנט הלא שלם של פרוינד לתערובת וחוזרים על תהליך הסוניקציה על קרח עד שהתחליב יוצר מרקם דמוי משחת שיניים.
- הגדר את ההספק ל- 0 באמצעות ידית הבקרה וכבה את היחידה כדי לסיים את הסוניקציה. הסר את הקצה מהמתלה ונגב את הבדיקה עם ספוגית אלכוהול.
- אחסנו את תחליב האנטיגן בטמפרטורה של 4°C. הכנת אצוות של האמולסיה תעזור להבטיח עקביות בין הניסויים. ניתן לאחסן את התחליב ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
2. הזרקה תת עורית
- יש לבצע הזרקה תת עורית שבוע לפני ההזרקה התוך ויטריאלית (יום 7-).
- טען מזרק 1 מ"ל (ללא מחט מחוברת) עם תחליב mycobacterial. בשל הצמיגות והאטימות של התחליב, בועות אוויר קשות לצפייה יכולות למלא את המזרק.
- כדי למנוע בועות אוויר במזרק, לאחר העמסת 0.2-0.3 מ"ל תחליב, הפוך את המזרק (קצה פונה כלפי מעלה) והקש בעדינות על המזרק שוב ושוב על קצה הדלפק כדי להביא את הבועות אל פני השטח.
- מוציאים את האוויר מהמזרק וממשיכים למלא את המזרק. יש להפוך ולטפוח לסירוגין עד למילוי.
- מניחים מחט 25 גרם על המזרק ומקדמים את התחליב למילוי המחט. אחסנו את המזרק על קרח עד לשימוש.
- כדי לבצע את ההזרקה התת עורית בבטחה, יש להרדים את העכבר או להשתמש בשיטות ריסון הומניות המאפשרות גישה נוחה לאחורי החיה.
- להרדים לצורך הזרקה תת עורית, הכניסו את בעל החיים לתא אינדוקציה איזופלורני (3%-4% לזירוז ו-1%-3% לתחזוקה). לאחר ההרדמה, ודא שלעכבר יש קצב נשימה איטי ואינו מראה סימנים של מצוקה נשימתית.
- מניחים את הזריקות תת עוריות על פני השטח הגבי של הירכיים או על פני השטח הגחוני של הרגליים פרוקסימלי לאזור בלוטות הלימפה המפשעות.
- הכנס בזהירות את המחט כדי למנוע הזרקה לתוך השריר. הזריקו 0.05 מ"ל של תחליב Mtb לחלל התת עורי. אין להסיר את המחט מיד על מנת לאפשר הזרקה מלאה של התחליב העבה.
- חזור על ההזרקה בצד שמאל ובצד ימין עבור סך של 0.1 מ"ל לכל חיה.
- במקרה של הרדמה, הניחו את העכבר על כרית חימום חמה עד להחלמה מלאה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה.
- החזירו את העכבר לכלוב עם החלמתו המלאה ותייגו את כרטיס הכלוב עם תאריך ההזרקה התת עורית.
- לספק משככי כאבים עם פרצטמול פומי (200 מ"ג / ק"ג / יום), אבל לא תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידים (NSAIDs) כמו סוכנים אנטי דלקתיים יכול להשפיע על השראת uveitis.