הכנה וכימות של Mycobacterium bovis BCG lux Inoculum לזיהום

תקציר

מקור: Asai, M. et al., שימוש בגלריה מלונלה חסרת חוליות כמודל זיהום לחקר קומפלקס השחפת Mycobacterium. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההכנה והכימות של Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inoculum באמצעות בדיקת ביולומינסנציה וספירה של יחידות יוצרות מושבה. החיסון המוכן יכול לשמש למחקרי זיהום.

פרוטוקול

הערה: כל העבודות המתוארות להלן יבוצעו במעבדת CL2 בתוך ארון בטיחות מיקרוביולוגי דרגה 2 (MSC) בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות.

1. הכנת M. bovis BCG lux לזיהום

1. הפשיר מלאי קפוא של 1.2 מ"ל גליצרול (15%) של M. bovis BCG lux, זן החיסון ממונטריאול שעבר טרנספורמציה עם פלסמיד המעבורת pSMT1 הנושא את הגנים luxAB מ- Vibrio harveyi המקודדים את האנזים לוציפראז.
2. יש לחסן 15 מ"ל של מרק Middlebrook 7H9 המכיל 0.2% גליצרול, 10% אלבומין, דקסטרוז, העשרת קטלאז (ADC) והיגרומיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל עם אליציטוט מופשר של 1.2 מ"ל BCG lux, בצלוחית Erlenmeyer מסומנת של 250 מ"ל.
3. מניחים את הבקבוק במיכל בטיחות ביולוגית אטום ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר אורביטלי ב-220 סל"ד למשך 72 שעות (או עד שהתרבית מגיעה לשלב אמצע הלוג של הצמיחה).
4. בדוק את הצמיחה של תרבית BCG lux על ידי הכנת דילול 1:10 של התרבית בצינורות לומנומטר באמצעות מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4, 0.01 M חיץ פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי, ו 0.137 M נתרן כלורי) כפול. מערבולת, ולטעון את צינורות הלומינומטר לתוך הלומינומטר ולמדוד את הביולומינסנציה (יחידת אור יחסית [RLU]/mL) באמצעות n-דציל אלדהיד כמצע (1% v/v באתנול מוחלט).
   הערה: היחס בין יחידות יוצרות RLU/מושבה (CFU) נקבע בעבר כ-3:1 כאשר BCG lux גדל במבחנה במרק Middlebrook 7H9.
5. צנטריפוגה את התרבית ב 2,175 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפטר את התאים ולהשליך את supernatant לתוך חומר חיטוי מתאים עם פעילות mycobactricidal ידוע. יש להשליך את כל פסולת התרבית בחומרי חיטוי המתאימים למיקובקטריה בהתאם להנחיות המקומיות.
6. שטפו את כדורית התא פעמיים ב-PBS המכילה 0.05% פוליסורבט 80 (PBS-T) למניעת התגבשות חיידקים.
7. לאחר השטיפה הסופית, דנקנט פסולת סופרנטנט, להשעות מחדש את כדורית התא המיקובקטריאלי ב- PBS-T, ולדלל את התרחיף המיקובקטריאלי לצפיפות התא הרצויה באמצעות מדידות RLU.
8. הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה של האינקולום בצלחות 24 בארות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 μL על לוחות אגר Middlebrook 7H11 (0.5% גליצרול, 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין, 10% חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז [OADC]) בשכפול כדי לספור את ספירת CFU inoculum.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור תגובה 1.5 מ"ל (Eppendorf)	אפנדורף	22431021
פיפטה 20, 200 ו 1000 μl וטיפים מסוננים	כל ספק	לא ישים
צלחת תרבות 24 בארות	גריינר	662160
25 מ"ל פיפטות ופיפטה בוי	כל ספק	לא ישים
צלחת פטרי בעלת 3 תאים (94/15 מ"מ)	גריינר	637102
צנטריפוגה	כל ספק	לא ישים
ארון ספטי סוג II	כל ספק	לא ישים
אתנול (>99.7%)	VWR	208221.321
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5150
היגרומיצין ב	קורנינג	30-240CR
לומנומטר (Autolumat LB 953)	ברתיולד	34622
צינורות לומנומטר	קורנינג	352054
מיקרוצנטריפוגה	כל ספק	לא ישים
אגר מידלברוק 7H11	BD Bioscience	283810
מרק מידלברוק 7H9	BD Bioscience	271310
העשרת ADC של מידלברוק	BD Bioscience	212352
Middlebrook OADC העשרה	BD Bioscience	212240
מיקובקטריום בוביס BCG לוקס	מגוון	לא ישים
N-דציל אלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	D7384-100G
אינקובטור רעידות מסלוליות	כל ספק	לא ישים
מלח חוצץ פוספט	סיגמא-אולדריץ'	P4417-100TAB
פוליסורבט 80 (טווין-80)	סיגמא-אולדריץ'	P8074-500 מ"ל
בקבוק Erlenmeyer עם פקק מאוורר (250 מ"ל)	קורנינג	CLS40183
Winterm (גרסה 1.08)	ברתיולד	לא ישים	תוכנית LB953.TTB