הערה: כל העבודות המתוארות להלן יבוצעו במעבדת CL2 בתוך ארון בטיחות מיקרוביולוגי דרגה 2 (MSC) בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות.
1. הכנת M. bovis BCG lux לזיהום
- הפשיר מלאי קפוא של 1.2 מ"ל גליצרול (15%) של Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, זן החיסון ממונטריאול שעבר טרנספורמציה עם פלסמיד המעבורת pSMT1 הנושא את הגנים luxAB מ- Vibrio harveyi המקודדים את האנזים luciferase.
- יש לחסן 15 מ"ל של מרק Middlebrook 7H9 המכיל 0.2% גליצרול, 10% אלבומין, דקסטרוז, העשרת קטלאז (ADC) והיגרומיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל עם אליציטוט מופשר של 1.2 מ"ל BCG lux, בצלוחית Erlenmeyer מסומנת של 250 מ"ל.
- מניחים את הבקבוק במיכל בטיחות ביולוגית אטום ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר אורביטלי ב-220 סל"ד למשך 72 שעות (או עד שהתרבית מגיעה לשלב אמצע הלוג של הצמיחה).
- בדוק את הצמיחה של תרבית BCG lux על ידי הכנת דילול 1:10 של התרבית בצינורות לומנומטר באמצעות מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4, 0.01 M חיץ פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי, ו 0.137 M נתרן כלורי) כפול. מערבולת, ולטעון את צינורות הלומינומטר לתוך הלומינומטר ולמדוד את הביולומינסנציה (יחידת אור יחסית [RLU]/mL) באמצעות n-דציל אלדהיד כמצע (1% v/v באתנול מוחלט).
הערה: היחס בין יחידות יוצרות RLU/מושבה (CFU) נקבע בעבר כ-3:1 כאשר BCG lux גודל במבחנה במרק Middlebrook 7H9.
- צנטריפוגה את התרבית ב 2,175 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפטר את התאים ולהשליך את supernatant לתוך חומר חיטוי מתאים עם פעילות mycobactricidal ידוע. יש להשליך את כל פסולת התרבית בחומרי חיטוי המתאימים למיקובקטריה בהתאם להנחיות המקומיות.
- שטפו את כדורית התא פעמיים ב-PBS המכילה 0.05% פוליסורבט 80 (PBS-T) למניעת התגבשות חיידקים.
- לאחר השטיפה הסופית, דנקנט פסולת סופרנטנט, להשעות מחדש את כדורית התא המיקובקטריאלי ב- PBS-T, ולדלל את התרחיף המיקובקטריאלי לצפיפות התא הרצויה באמצעות מדידות RLU.
- הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה של האינקולום בצלחות 24 בארות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 μL על לוחות אגר Middlebrook 7H11 (0.5% גליצרול, 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין, 10% חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז [OADC]) בשכפול כדי לספור את ספירת CFU inoculum.
2. הכנת זחלי G. mellonella
- רכשו זחלי אינסטאר אחרונים ממקורות מתאימים ושמרו על הזחלים בחושך בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס עם ההגעה והשתמשו תוך שבוע מיום הרכישה. לחלופין, ניתן לגדל זחלים באופן עצמאי בהתאם לפרוטוקול של Jojāo et al. עבור זחלים שנרכשו, יש להשליך את כל הזחלים המתים, הדהויים או הגלמים לפני האחסון.
הערה: ניתן להבחין מורפולוגית בין זחלי הגלמים לבין זחלי האינסטאר האחרונים.
- לזהות ולבחור זחלים בריאים לניסויים, בהתבסס על צבע קרם אחיד עם מעט או ללא שינוי צבע (מלניזציה), גודל (2-3 ס"מ אורך), משקל (כ 250 מ"ג), הפגין רמה גבוהה של תנועתיות, ובעל יכולת לתקן את עצמם כאשר הופכים אותם.
- ספרו בזהירות את הזחלים הבריאים (מינימום 20-30 לקבוצה) לתוך צלחת פטרי (94/15 מ"מ) מרופדת בשכבת נייר סינון (94/15 מ"מ) באמצעות פינצטה קהה כדי למזער את הזיהום ולאחסן בטמפרטורת החדר בחושך עד לשימוש.
3. הדבקת G. mellonella ב-BCG lux
- מזער את העומס בתוך MSC כדי להפחית את הסיכון לזיהום ולפגיעה במקל מחט.
- הכינו את משטח ההזרקה על ידי הדבקת נייר סינון עגול (94 מ"מ) על משטח שטוח מוגבה. ניתן להשתמש במשטחים רכים או קשים והם תלויים לחלוטין בהעדפת המשתמש, למשל מכסי קופסת פיפטה או ספוג ניילון סורק.
- יש לעקר מיקרו-מזרק בנפח 25 מיקרו-ליטר (25 גרם) על ידי שאיפת 3 נפחים של 70% אתנול ולשטוף עוד יותר עם 3 כרכים של PBS-T סטרילי.
- יש לשאוף 10 μL של BCG lux inoculum (מוכן בסעיף 1) או PBS-T לתוך מיקרומזרק מעוקר של 25 μL. השתמש מזרק נפרד עבור PBS-T negative control.
הערה: יש להשעות מחדש את BCG lux inoculum לאחר 10 זריקות כדי להבטיח השעיה אחידה של התאים.
- השתמשו בפינצטה כדי להרים זחל אחד ולהניח אותו על משטח ההזרקה.
- על הרציף, להפוך את הזחל על גבו ולשתק אותו על ידי אבטחת הראש והזנב עם פינצטה. אתר את הפרולג השמאלי האחרון שסופר לאחור מראש הזחל והכנס בזהירות את קצה המחט (5-6 מ"מ) בזווית של 10-20° למישור האופקי.
הערה: פינצטה קצרה וצרה מאפשרת השתקה קלה עם מינימום לחץ זחל. שימו לב לא לחדירת יתר שעלולה לנקב את המעי ולגרום למלניזציה ספציפית שאינה BCG או למוות.
- ספרו את הזחלים הנגועים לתוך צלחת פטרי מרופדת בשכבת נייר פילטר, צלחת פטרי אחת בקוטר 90 מ"מ יכולה להכיל עד 30 זחלים.
- אחסנו את צלחת הפטרי המכילה את הזחלים בקופסה כהה מאווררת או לא אטומה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2.
4. מעקב אחר הישרדות G. mellonella לאחר זיהום
- במהלך מסלול הזמן, לפקח על הישרדות הזחלים כל 24 שעות. הזחלים נחשבים למתים כאשר הם אינם מצליחים לזוז בתגובה למגע.
5. מדידת נטל In Vivo של BCG lux ב- G. mellonella
- בכל נקודת זמן, בחרו באופן אקראי חמישה זחלים נגועים שהוכנו בעבר בסעיף 3 ועיקרו בעדינות את משטחי הזחלים באמצעות מקלוני צמר גפן ספוגים באתנול 70%.
הערה: שלב זה חשוב בעת ציפוי הומוגנט הזחל לספירת CFU מיקובקטריאלית מכיוון שזחלים לא מעוקרים עלולים להוביל לזיהום.
- הניחו את הזחלים בנפרד לתוך 2 מ"ל צינורות מטריקס ליסינג המכילים 800 μL של PBS סטרילי.
- הומוגניזציה של הזחלים באמצעות הומוגנייזר במשך 60 שניות במהירות של 6.0 מטר לשנייה.
- צנטריפוגה את צינורות הליסינג ב 3,500 x גרם במשך 5 שניות כדי להסיר הומוגנט מן המכסים, בזהירות decate לתוך צינורות luminometer סטרילי בנפרד.
הערה: עבור ספירת CFU (שלב 5.7), הקפד לשמור 100 μL של הומוגנט בצינור תגובה סטרילי של 1.5 מ"ל.
- לשחזר כל הומוגנט שנותר על ידי שטיפת צינורות מטריצת lysing עם 1 מ"ל של PBS-T פיפטה לתוך צינורות luminometer המתאימים.
- מערבלים את צינורות הלומינומטר ומודדים את הביולומינסנציה של ההומוגנטים שתוארו קודם לכן בשלב 1.4.
- הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה של ההומוגנט בלוחות תרבית של 24 בארות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 μL של דילול על לוחות אגר Middlebrook 7H11 המכילים 0.5% גליצרול, 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין, 10% OADC, ו 20 מיקרוגרם / מ"ל piperacillin, כדי לקבוע את יחס RLU/CFU של BCG lux בעקבות זיהום in vivo.
הערה: Piperacillin מסלק מיקרוביוטה מקומית של G. mellonella עם עיכוב גדילה מינימלי של BCG lux.
